اصول کلی روش الکتروفورز Electrophoresis

الکتروفورز (Electrophoresis)
الکتروفورز یکی از تکنیک‌های آنالیتیکی قدرتمند در جداسازی و آنالیز دامنه وسیعی از آنالیت‌ها محسوب می‌گردد. آنالیت‌هایی که بطور ویژه مورد توجه قرار می‌گیرند عبارتند از: پروتئین‌ها، آمینواسیدها، اسیدهای نوکلئیک و الیگو نوکلئوتیدها، قندها، داروهای موجود در مایعات و بافت‌های بدن. اصطلاح الکتروفورز اشاره به حرکت همه ترکیبات یا ذرات باردار در یک محلول (محیط مایع) تحت تأثیر جریان الکتریکی دارد.

ترکیبات شیمیایی دارای بار الکتریکی به سمت قطب آند و یا کاتد (با توجه به نوع بار الکتریکی) حرکت می‌نمایند. آمفولیت‌ها (Ampholytes) ترکیباتی هستند که بسته به pH محیط (قلیایی بودن یا اسیدی بودن) دارای بار منفی یا بار مثبت می‌باشند. برای مثال آمینواسیدها که پروتون‌هایی حاوی گروه‌های -NH₂ و -COOH می‌باشند، و نیز بارهای موجود در اسیدهای نوکلئیک به صورت مثبت یا منفی باشند، در محلول‌ها دارای رفتاری مشابه رفتار آمفولیت‌ها می‌باشند.

سرعت حرکت ترکیبات موجود در یک نمونه در الکتروفورز به عوامل زیر وابسته است:

بار الکتریکی خالص یون
اندازه و شکل یون
شدت میدان الکتریکی
خواص محیط پایه (Support medium)
دمای محیط الکتروفورزی

حرکت الکتروفورزی (μ) جرمی تعریف شده عبارت است از میزان حرکت ذرات (برحسب cm/s) در واحد میدان الکتریکی (برحسب Volt/cm) که با μ بیان داده می‌شود و بر حسب cm²/V.s اندازه‌گیری می‌گردد:

μ=Qfμ = \frac{Q}{f}μ=fQ

که در آن:
μ: حرکت الکتروفورزی
Q: بار الکتریکی خالص یون

r: شعاع یون
η: ویسکوزیته محیط (بافر)

بطور کلی نیروهای تأثیر گذارنده بر حرکت الکتروفورزی را میتوان به دو گروه تقسیم نمود:

نیروی رانشی یا جلوبرنده (Driving force) که مربوط به میدان الکتریکی یون مربوطه می‌باشد.
نیروی بازدارنده (Retarding force) که مربوط به مقاومت محیط نگهدارنده می‌باشد.

با توجه به معادله بالا مشخص می‌گردد که حرکت الکتروفورزی ارتباط مستقیم با بار خالص یون (Q) و ارتباط معکوس با اندازه ملکول (r) و ویسکوزیته محیط الکتروفورز (η) در حال انجام می‌باشد.

هنگامی که الکتروفورز در حال انجام میباشد به مرور دماي محیط پایه و بافرها افزایش می یابد که منجر به تبخیر حلال میگردد ,این اثر(خشک کنندگی) سبب صعود بافر از هردو بخش بافري(درون دو تانک بافري ) به درون محیط پایه میگردد ,این جریان دوطرفه بر حرکت یونها تاثیر میگذارد (Wick flow).

وسایل و مواد مورد نیاز:

یک دستگاه (سیستم) الکتروفورز شامل بخش‌های زیر می‌باشد:

دو تانک بافر (Buffer boxes) که بافرهای الکتروفورزی در آن ریخته می‌شود
الکترودها
محیط پایه الکتروفورزی (Support media)
صفحه پوشاننده (Cover) جهت جلوگیری از تبخیر
سیستم تأمین کننده جریان الکتریکی (Power supply)
بافر (تامپون)

آگارز (Agarose):
آگار پلی‌ساکارید اسیدی می‌باشد که محتوی مونومرهایی از گالاکتوز سولفاته می باشد.

آگارز در واقع همان آگاري است که فاقد گروه سولفات می باشد ناخالصی در آگارز و وجود آگار و آگاروپکتین که داراي گروههاي سولفات و کربوکسیلیک اسید می باشند (موجب اختلال در حرکت ملکولها و نیز در رنگ آمیزي میگردد ولی در آگارز خالص به دلیل اینکه گروههاي قابل یونیزه مذکور وجود ندارد کارایی بهتري در جداسازي ترکیبات به روش الکتروفورز دارد .از لحاظ عملی محلولهاي بافر حاوي gr/dL1 -5/0آگارز ,ایجاد کننده ژلی با قدرت یونی مناسب براي جداسازي پروتئینها و قطعات DNAبا طول 5/0تا 20هزار جفت باز (kilo base pair = kbp) میباشد.