رنگ آمیزی
هم در تحقیقات پایه و هم در بررسی/تشخیص بالینی، رنگ آمیزی سلولی یک تکنیک ضروری و مفید برای تجسم مورفولوژی و ساختار سلولی در زیر میکروسکوپ است.رنگآمیزی یک فرآیند پزشکی رایج در تشخیص پزشکی تومورها است که در آن یک رنگ بر روی مرز خلفی و قدامی بافتهای نمونه اعمال میشود تا سلولهای بیمار یا تومور یا سایر سلولهای پاتولوژیک را تعیین کند .
لکه ها ممکن است برای تعریف بافت های بیولوژیکی استفاده شوند (به عنوان مثال، برجسته کردن،فیبرهای عضلانی یا بافت همبند ، ) جمعیت های سلولی (طبقه بندی سلول های خونی مختلف )، یا اندامک های درون سلول های منفرد.
رنگ آمیزی فقط به مواد بیولوژیکی محدود نمی شود، زیرا می توان از آن برای مطالعه ساختار سایر مواد نیز استفاده کرد. به عنوان مثال، ساختارهای لایه ای پلیمرهای نیمه کریستالی یا ساختارهای حوزه کوپلیمرهای بلوکی.
رنگ آمیزی بافت و سلول
مراحل عملکرد رنگ آمیزی
آماده سازی نمونه
پایه های مرطوب برای مشاهده موجودات زنده استفاده می شوند و می توان آنها را با استفاده از آب و لکه های خاص ساخت. مایع قبل از افزودن ارگانیسم به اسلاید اضافه می شود و یک ورقه پوششی روی نمونه در آب و لکه قرار میگیرد تا به مهار آن در میدان دید کمک کند.
تثبیت ، که خود ممکن است شامل چندین مرحله باشد، با هدف حفظ شکل سلول ها یا بافت های درگیر تا حد امکان انجام می شود. گاهی اوقات از تثبیت حرارتی برای از بین بردن، چسبیدن و تغییر نمونه استفاده می شود تا لکه ها را بپذیرد. اکثر فیکساتورهای شیمیایی (مواد شیمیایی که باعث تثبیت می شوند) پیوندهای شیمیایی بین پروتئین ها و سایر مواد داخل نمونه ایجاد می کنند و سفتی آنها را افزایش می دهند. تثبیت کننده های رایج عبارتند از فرمالدئید ، اتانول ، متانول و/یا اسید پیکریک . تکههای بافت را میتوان در موم پارافین جاسازی کرد تا استحکام و پایداری مکانیکی آنها را افزایش دهد و برش دادن آنها را به برشهای نازک آسانتر کند.
نفوذپذیری شامل درمان سلول ها با (معمولا) یک سورفکتانت خفیف است. این درمان غشای سلولی را حل میکند و به مولکولهای رنگ بزرگتر اجازه ورود به داخل سلول را میدهد.
اتصال معمولاً شامل چسباندن نمونه ها به لام میکروسکوپ شیشه ای برای مشاهده و تجزیه و تحلیل است. در برخی موارد، سلول ها ممکن است مستقیماً روی یک اسلاید رشد کنند. برای نمونههای سلولهای شل (مانند اسمیر خون یا پاپ اسمیر )، نمونه را میتوان مستقیماً روی یک لام قرار داد. برای تکه های بزرگتر بافت، بخش های نازک (برش ها) با استفاده از میکروتوم ساخته می شوند . سپس می توان این برش ها را سوار و بررسی کرد.
رنگ آمیزی سلولی
نمونه با رنگ بنفش کریستالی رنگ آمیزی می شود و قبل از اینکه زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار گیرد، مراحل بیشتری را طی می کند.
قسمت اسیدی لکه با اجزای اساسی سلول ها مانند هموگلوبین متحد می شود و به همین دلیل به آنها ائوزینوفیل می گویند و به رنگ صورتی یا قرمز رنگ می شوند. اجزای اسیدی سلول مانند اسیدهای نوکلئیک از طرف دیگر رنگ پایه را می گیرند و رنگ آبی یا بنفش را می گیرند.
رنگهای تیونین و تولویدین بلو معمولاً برای رنگآمیزی سریع انتخاب منجمد با استفاده از خاصیت متاکروماتیک آنها برای رنگآمیزی متفاوت هسته و سیتوپلاسم استفاده میشوند.
انواع رنگ آمیزی
موردانت ها عوامل شیمیایی هستند که قدرت ایجاد رنگ برای لکه دار کردن موادی دارند که در غیر این صورت غیر قابل لک هستند.
موردانت ها به دو دسته تقسیم می شوند:
الف) رنگدانه اصلی: با رنگهای اسیدی مانند آلوم، سولفات آهن، کلرید ستیل پیریدینیم و غیره واکنش نشان می دهند.
ب) رنگ اسیدی: با رنگهای اساسی مانند اسید پیکریک، اسید تانیک و غیره واکنش می دهند.
رنگ آمیزی مستقیم: بدون رنگ آمیزی انجام می شود.
رنگ آمیزی غیرمستقیم: رنگ آمیزی با کمک ضایعات:
Sr No. نام تکنیک رنگ آمیزی غیر مستقیم
نام موردانت اعمال شد
1.) رنگ آمیزی گرم ید گرم
2.) رنگ آمیزی دیواره سلولی
الف) روش رینگر
ب) روش دیار 10% تانیک اسید
0.34٪ CPC
3.) رنگ آمیزی تاژک
الف) روش لیفسون
ب) روش لوفلر اسید تانیک در لکه لیفسون
قرص لوفلر (20% تانیک اسید)
4.) رنگ آمیزی اسپیروکت
الف) روش فونتانا
ب) روش بکر داروی فونتانا (5% تانیک اسید)
داروی فونتانا (5% تانیک اسید)
رنگ آمیزی منفی
یک روش ساده رنگآمیزی برای باکتریها که معمولاً موفق است، حتی زمانی که روشهای رنگآمیزی مثبت با شکست مواجه میشوند، استفاده از لکه منفی است . این را می توان با آغشته کردن نمونه به لام و سپس استفاده از نیگروسین (رنگ مصنوعی سیاه) یا جوهر هند (یک سوسپانسیون آبی از ذرات کربن) به دست آورد. پس از خشک شدن، میکروارگانیسمها را میتوان در میکروسکوپ میدان روشن بهعنوان آخالهای سبکتر مشاهده کرد که به خوبی با محیط تاریک اطراف آنها تضاد دارند. رنگآمیزی منفی میتواند پسزمینه را به جای ارگانیسمها رنگ آمیزی کند، زیرا دیواره سلولی میکروارگانیسمها معمولاً دارای بار منفی است که لکهای با بار منفی را دفع میکند. رنگ های مورد استفاده در رنگ آمیزی منفی اسیدی هستند.
نکته: رنگآمیزی منفی روشی ملایم است که ممکن است میکروارگانیسمها را از بین نبرد و بنابراین برای مطالعه پاتوژنها نامناسب است.
رنگ آمیزی مثبت
برخلاف رنگآمیزی منفی، رنگآمیزی مثبت از رنگهای پایه برای رنگآمیزی نمونه در برابر پسزمینه روشن استفاده میکند. در حالی که کروموفور برای رنگآمیزی منفی و مثبت به طور یکسان استفاده میشود، نوع کروموفور مورد استفاده در این تکنیک به جای یون منفی، یک یون با بار مثبت است. دیواره سلولی با بار منفی بسیاری از میکروارگانیسمها کروموفور با بار مثبت را جذب می کند که باعث می شود نمونه لکه را جذب کند و به آن رنگ لکه مورد استفاده را می دهد. رنگآمیزی مثبت بیشتر از رنگآمیزی منفی در میکروبیولوژی استفاده میشود. انواع مختلف رنگ آمیزی مثبت در زیر ذکر شده است.
رنگ آمیزی ساده
رنگ آمیزی ساده تکنیکی است که در آن تنها از یک نوع لکه در یک لام در یک زمان استفاده می شود. از آنجایی که فقط از یک لکه استفاده می شود، نمونه ها (برای لکه های مثبت) یا پس زمینه (برای لکه های منفی) یک رنگ خواهند بود. بنابراین، لکه های ساده معمولاً برای مشاهده تنها یک ارگانیسم در هر اسلاید استفاده می شود.
رنگ آمیزی دیفرانسیل
رنگآمیزی دیفرانسیل از چندین لکه در هر لام استفاده میکند. بر اساس لکه هایی که استفاده می شود، ارگانیسم هایی با خواص مختلف رنگ های متفاوتی به نظر می رسند که امکان دسته بندی چندین نمونه را فراهم می کند. همچنین می توان از رنگ آمیزی دیفرانسیل برای رنگ آمیزی اندامک های مختلف در یک ارگانیسم استفاده کرد که در رنگ آمیزی اندوسپور دیده می شود.
برخی از انواع تکنیک های رنگ آمیزی
شماره سریال تکنیک رنگ آمیزی آماده سازی کاربرد نتیجه
1 گرم رنگآمیزی اولیه: کریستال بنفش روی فیلم اعمال میشود، سپس با ید (موادانت)، الکل (رنگزدا) درمان میشود و با سافرانین رنگآمیزی میشود. باکتری ها را در یکی از دو گروه گرم مثبت یا گرم منفی مشخص می کند گرم مثبت به رنگ بنفش به نظر می رسد
گرم منفی به رنگ صورتی به نظر می رسد
2 اسید فست (تکنیک Ziehl-Neelsen) فیلم آغشته به رنگ زدایی داغ ZNCF (اسید الکل) و ضد لکه با متیلن بلو باکتریهای اسید فست رنگزدایی نشده را از باکتریهای غیر اسید فست رنگی جدا کنید. باکتری اسید سریع: قرمز
بدون اسید سریع: آبی
3 اندوسپور (روش دورنور) لکه اولیه مالاکیت سبز حرارت ثابت برای نفوذ به هاگ. سلول های رویشی با سافرانین ضدرنگ می شوند وجود اندوسپورها را در شش جنس باکتری تشخیص می دهد اندوسپورها: سبز
سلول های رویشی: قرمز
4 کپسول
الف: روش هیس (تکنیک مثبت)
ب: تکنیک مانوال (منفی) پس از درمان با سولفات مس، با لکه هیس رنگ آمیزی شود
سوسپانسیون باکتریایی با رنگ قرمز کنگو آغشته شده و لکه Maneval اعمال می شود. کپسول ها را می توان به عنوان مناطق شفاف اطراف سلول های باکتری کپسوله شده مشاهده کرد و برای نشان دادن وجود کپسول استفاده می شود. کپسول: رنگ بنفش روشن/ ارغوانی کم رنگ
باکتری: کپسول بنفش، سلول باکتریایی، در پس زمینه تاریک متمایز می شود
5 دیواره سلولی (روش دیار) اسمیر تحت درمان با CPC قرار می گیرد که جدا می شود تا ستیل پیریدینیوم با بار مثبت و یون های کلرید با بار منفی تشکیل شود. یون های دارای بار مثبت روی دیواره سلولی با بار منفی جذب می شوند دیواره سلولی باکتری را لکه دار می کند دیواره سلولی: سیتوپلاسم قرمز: آبی
6 تاژک (روش لیفسون) موردانت قبل از رنگآمیزی تاژکها را ضخیم میکند و در صورت رنگآمیزی با رنگآمیزی لیفسون، دید را از نظر میکروسکوپی افزایش میدهد. حضور تاژک را نشان می دهد تاژک: سلول های رویشی قرمز: آبی
7 مواد هسته ای (تکنیک Feulgen) اسمیر برای هیدرولیز درمان می شود تا پورین ها از DNA آزاد شوند، پورین ها برای ایجاد تغییر از فورانوز به آلدئید. گروه های آلدئیدی برای واکنش با معرف شیف برای تشکیل ترکیبات افزودنی در دسترس هستند. برای نشان دادن حضور DNA در سلول. اما برای تشخیص DNA، RNA باید به طور انتخابی توسط هیدرولیز اسید بدون تأثیر بر DNA از بین برود مواد هسته ای - بنفش مایل به صورتی،
سیتوپلاسم - بی رنگ
8 گرانول های متاکروماتیک (روش آلبرتز) اسمیر ابتدا با کلروفرم درمان می شود تا چربی ها از بین بروند. اسمیر با رنگ آلبرتس که حاوی رنگهای کاتیونی مانند تولویدین آبی و مالاشیت سبز است اعمال می شود. تولویدین آبی ترجیحاً گرانول ها را رنگ می کند در حالی که مالاکیت سبز سیتوپلاسم را رنگ می کند. گرانول ها ماهیت تک رنگی معمولی را نشان می دهند، این برای نشان دادن گرانول ها استفاده می شود گرانول ها: سیاه مایل به آبی، سیتوپلاسم: سبز
9 لیپیدهای داخل سلولی (روش بوردون) لیپیدها با رنگ های محلول در چربی مانند سیاه سودان رنگ آمیزی می شوند. با استفاده از رنگهای سیاه-B سودان به لیپیدها منتقل میشوند و در آنجا باقی میمانند در حالی که سیتوپلاسم با سافرانین رنگآمیزی میشود. برای تشخیص وجود لیپیدها در دیواره سلولی، غشای سلولی یا گلبول های چربی (PHB در سیتوپلاسم) گرانول های لیپید: آبی تیره،
سیتوپلاسم: صورتی روشن
10 پلی ساکارید (روش هوچ کوس) پلی ساکارید با پریودات اکسید می شود و پلی آلدئید تشکیل می دهد که با واکنشگرهای شیف به رنگ قرمز واکنش می دهد، در حالی که سیتوپلاسم با مالاشیت سبز رنگ آمیزی می شود. تجمع گرانول های پلی ساکارید را در سلول ها تشخیص می دهد پلی ساکارید: قرمز
سیتوپلاسم: سب
برخی از رنگ آمیزی رایج
Ziehl–Neelsen
رنگآمیزی Ziehl–Neelsen یک رنگآمیزی اسیدی است که برای رنگآمیزی گونههایی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس که با روشهای رنگآمیزی استاندارد آزمایشگاهی مانند رنگآمیزی گرم رنگ نمیشوند، استفاده میشود.
این لکه با استفاده از فوشسین کربول قرمز رنگی که باکتری ها را لکه دار می کند و لکه ضد رنگی مانند متیلن بلو انجام می شود.
هماتوکسیلین و ائوزین (H&E)
رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین اغلب در بافت شناسی برای بررسی مقاطع بافت نازک استفاده می شود. هماتوکسیلین هسته سلول را آبی رنگ می کند، در حالی که ائوزین سیتوپلاسم، بافت همبند و سایر مواد خارج سلولی را به رنگ صورتی یا قرمز رنگ می کند. ائوزین به شدت توسط گلبول های قرمز جذب می شود و آنها را قرمز روشن می کند. در یک آماده سازی H&E که به طرز ماهرانه ای ساخته شده است، گلبول های قرمز خون تقریباً نارنجی هستند و کلاژن و سیتوپلاسم (مخصوصاً ماهیچه ها) سایه های مختلف صورتی پیدا می کنند.
شرایط بهینه برای رنگ آمیزی
هرچه PH بالاتر باشد، رنگآمیزی قویتر و سریعتر توسط رنگهای پایه انجام میشود. در pH 8 یا بالاتر، همه چیز را لکه دار می کند.