پپسین چیست

پپسین یک اندوپپتیداز است که پروتئین‌ها را به پپتیدها و اسیدهای آمینه کوچکتر تجزیه می‌کند. این آنزیم یکی از آنزیم‌های اصلی گوارشی در دستگاه گوارش انسان و بسیاری از جانوران دیگر است که در هضم پروتئین‌های موجود در غذا نقش دارد. پپسین یک آسپارتیک پروتئاز (aspartic protease) است، که از یک باقیمانده آسپارتات کاتالیتیک در جایگاه فعال خود استفاده می‌کند. 

پپسین یکی از سه اندوپپتیداز اصلی (آنزیم‌هایی که پیوندهای پپتیدی را در میانه پروتئین می‌برند) در سیستم گوارشی انسان است؛ دو آنزیم دیگر کیموتریپسین (chymotrypsin) و تریپسین (trypsin) هستند. همچنین آنزیم‌هایی به نام اگزوپپتیدازها (exopeptidases) وجود دارند که اسیدهای آمینه را از دو انتهای زنجیره پروتئینی جدا می‌کنند (کاربوکسی‌پپتیدازها توسط پانکراس و آمینوپپتیدازها توسط روده کوچک ترشح می‌شوند). در فرآیند هضم، این آنزیم‌ها که هر یک در بریدن پیوند بین انواع خاصی از اسیدهای آمینه تخصص دارند، به صورت هماهنگ عمل کرده و پروتئین‌های غذایی را به اجزای سازنده‌شان یعنی پپتیدها و اسیدهای آمینه تجزیه می‌کنند، به‌گونه‌ای که توسط روده کوچک به‌راحتی جذب شوند. ویژگی اختصاصی برش پپسین گسترده است، اما اسیدهای آمینه‌ای مانند تیرزین (tyrosine)، فنیل‌آلانین (phenylalanine) و تریپتوفان (tryptophan) احتمال برش را افزایش می‌دهند.

زایموژن (پیش‌آنزیم) پپسین، یعنی پپسینوژن، توسط سلول‌های اصلی (chief cells) دیواره معده آزاد می‌شود و پس از ترکیب با اسید هیدروکلریک موجود در شیره معده، فعال شده و به پپسین تبدیل می‌شود.

تاریخچه

پپسین یکی از نخستین آنزیم‌هایی است که کشف شد. این کشف در سال ۱۸۳۶ توسط «تئودور شوآن (Theodor Schwann)» انجام شد. شوآن نام این آنزیم را از واژه یونانی πέψις (pepsis) به‌معنای "هضم" (از واژه πέπτειν (peptein) به‌معنای "هضم کردن") برگرفت. یک ماده اسیدی که می‌توانست غذاهای حاوی نیتروژن را به موادی محلول در آب تبدیل کند، بعدها مشخص شد همان پپسین است.

در سال ۱۹۲۸، پپسین یکی از نخستین آنزیم‌هایی بود که به شکل کریستال در آمد. این کار توسط «جان اچ. نورتروپ (John H. Northrop)» از طریق روش‌های دیالیز، فیلتراسیون و سرمایش انجام شد.

پیش‌ساز (Precursor)

پپسین به صورت زایموژنی به نام پپسینوژن بیان می‌شود که ساختار اولیه آن ۴۴ اسید آمینه بیشتر از فرم فعال آن دارد.

در معده، سلول‌های اصلی (chief cells) پپسینوژن را ترشح می‌کنند. این زایموژن توسط اسید هیدروکلریک (HCl) فعال می‌شود که از سلول‌های جداری (parietal cells) دیواره معده ترشح می‌گردد. هورمون گاسترین و عصب واگ آزادسازی هر دو ماده یعنی پپسینوژن و HCl را پس از ورود غذا به معده تحریک می‌کنند. اسید هیدروکلریک محیطی اسیدی ایجاد می‌کند که به پپسینوژن اجازه می‌دهد باز شده و به‌صورت خودکاتالیتیک (خودبُرنده) خودش را بشکند و پپسین فعال تولید شود. پپسین، ۴۴ اسید آمینه ابتدایی پپسینوژن را قطع کرده و پپسین بیشتری تولید می‌کند.

پپسینوژن‌ها بر اساس ساختار اولیه‌شان عمدتاً به ۵ گروه طبقه‌بندی می‌شوند:

• پپسینوژن A (که پپسینوژن I نیز نامیده می‌شود)،

• پپسینوژن B،

• پروگاستریکسین (progastricsin) که به نام‌های پپسینوژن II و پپسینوژن C نیز شناخته می‌شود،

• پروکیموزین (prochymosin) یا پرورنین (prorennin)،

• و پپسینوژن F (که به عنوان گلیکوپروتئین مرتبط با بارداری نیز شناخته می‌شود).

فعالیت و پایداری

پپسین در محیط‌های اسیدی با pH بین ۱.۵ تا ۲.۵ بیشترین فعالیت را دارد. بنابراین، محل اصلی سنتز و فعالیت آن در معده (با pH حدود ۱.۵ تا ۲) است. در انسان، غلظت پپسین در معده به حدود ۰.۵ تا ۱ میلی‌گرم در هر میلی‌لیتر می‌رسد.

پپسین در pH برابر یا بالاتر از ۶.۵ غیرفعال است، اما تا زمانی که به pH ۸.۰ نرسد، به‌طور کامل دناتوره یا غیرقابل برگشت نمی‌شود. بنابراین، پپسین موجود در محلول‌هایی با pH تا ۸.۰ را می‌توان پس از بازاسیدی‌سازی، مجدداً فعال کرد. این پایداری پپسین در pH بالا، تأثیر قابل‌توجهی بر بیماری بازگشت معده‌ای-حنجره‌ای (laryngopharyngeal reflux) دارد. پپسین می‌تواند پس از بازگشت اسید معده به حنجره باقی بماند. در pH میانگین حنجره (pH ≈ ۶.۸) پپسین غیرفعال است، اما در صورت وقوع مجدد بازگشت اسید، می‌تواند دوباره فعال شود و به بافت‌های محلی آسیب وارد کند.

ویژگی برش آنزیمی (Cleavage Specificity)

پپسین دارای دامنه وسیعی از ویژگی برش است. این آنزیم می‌تواند تا ۲۰٪ از پیوندهای آمیدی مصرف‌شده را هضم کند. باقی‌مانده‌های اسید آمینه در موقعیت‌های P1 و P1’ در تعیین احتمال برش نقش اصلی دارند. به طور کلی، حضور اسیدهای آمینه آب‌گریز (هیدروفوب) در این موقعیت‌ها، احتمال برش را افزایش می‌دهد. وجود فنیل‌آلانین، لوسین و متیونین در موقعیت P1، و فنیل‌آلانین، تریپتوفان و تیرزین در موقعیت P1'، بیشترین احتمال برش را دارند. از سوی دیگر، حضور اسیدهای آمینه با بار مثبت مانند هیستیدین، لیزین و آرژینین در موقعیت P1، احتمال برش را کاهش می‌دهد.

پپسینوژن، مولکولی است که از دو لوب N-ترمینال و C-ترمینال تشکیل شده و در pH قلیایی پایدار باقی می‌ماند؛ اما زمانی که pH محیط به کمتر از ۵ کاهش می‌یابد، لوب N-ترمینال جدا شده و پپسین فعال آزاد می‌شود. وزن مولکولی این پپسین فعال بین ۳۴ تا ۳۷ کیلو دالتون گزارش شده است.

مطالعات نشان داده‌اند که فعالیت پپسین در محیط‌های اسیدی به دلیل وجود گروه فسفریله‌ای متصل به باقی‌مانده Ser68 به‌صورت کووالانسی بهبود می‌یابد. این ویژگی باعث می‌شود که پپسین خوکی حتی در pHهای پایین نیز دارای بار خالص منفی باشد، که کارایی بالای آن را در محیط اسیدی (pH بین ۱ تا ۳) توجیه می‌کند.

ویژگی اختصاصی بودن پپسین عمدتاً به دلیل نوع اسیدآمینه‌های قرار گرفته در موقعیت‌های P1 و P1′ است. این آنزیم تمایل دارد پیوندهایی را قطع کند که در آن‌ها اسیدآمینه‌های آب‌گریز (هیدروفوبیک) مانند فنیل‌آلانین، تریپتوفان و تیروزین حضور دارند.

پپسین، به‌ویژه از منابع خوکی، گاوی و میکروبی، یکی از مهم‌ترین آنزیم‌های صنعتی محسوب می‌شود و حدود ۶۰٪ از آنزیم‌های تجاری موجود در بازار را تشکیل می‌دهد . این آنزیم در صنایع مختلف از جمله دباغی چرم، شوینده‌ها، کشاورزی، صنایع غذایی و دارویی کاربرد گسترده‌ای دارد.

از پپسین همچنین در تولید پپتیدهایی با فعالیت‌های زیستی مهم نظیر:

• آنتی‌اکسیدانی 

• ضد فشار خون بالا (آنتی‌هیپرتنسیو) 

• ضد میکروبی

• و سایر ویژگی‌ها و عملکردهای زیستی مهم 

به‌طور وسیع استفاده می‌شود.

نکته بسیار مهم دیگر اینکه درمان پروتئین‌ها با پپسین می‌تواند منجر به کاهش آلرژن‌زایی آنها شود. این ویژگی ارتباط مستقیم با یکی از وظایف اصلی پپسین در سیستم گوارش دارد، زیرا پپسین نقش مهمی در جلوگیری از ورود پپتیدهای آلرژن به لومن روده ایفا می‌کند. بنابراین، پپسین می‌تواند در تولید پپتیدها یا هیدرولیزات‌هایی با آلرژن‌زایی کمتر و در عین حال دارای فعالیت‌های زیستی بالا به‌کار رود.

تولید پپتیدهای زیست‌فعال را می‌توان با آنزیم‌های پروتئازی گوناگون نیز انجام داد؛ از جمله:

• آلکالاز (Alcalase)

• پاپائین

• فلیورزیم (Flavourzyme) 

• نوتراز (Neutrase) 

با این حال، پپسین نسبت به بسیاری از این آنزیم‌ها برتری‌هایی دارد؛ به‌ویژه از نظر انتخاب‌پذیری در برش پیوندهای حاوی اسیدهای آمینه آب‌گریز . در نتیجه، پپتیدهای حاصل معمولاً در انتهای خود دارای اسیدهای آمینه‌ای مانند لوسین، ایزولوسین یا والین هستند که این ترکیب‌ها دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی و مهارکنندگی آنزیم ACE بیشتری نسبت به پپتیدهای فاقد این گروه‌ها می‌باشند.

در نتیجه، پپسین به‌عنوان یک پروتئاز، جذابیت بالایی برای تولید پپتیدهایی با عملکردهای زیستی قوی دارد و به‌عنوان ابزاری مؤثر در زیست‌فناوری، صنایع دارویی و تغذیه‌ای مورد توجه قرار گرفته است.

 تولید و استخراج پپسین

پپسین به طور سنتی از مخاط معده حیوانات، به ویژه خوک و گاو که محصولات جانبی صنعت گوشت هستند، استخراج می‌شود. فرآیند استخراج شامل هموژنیزه کردن بافت معده و سپس استفاده از رسوب‌دهی اسیدی و مراحل خالص‌سازی مانند رسوب‌دهی با سولفات آمونیوم و کروماتوگرافی است.

تقاضای زیاد برای پپسین باعث توسعه روش‌های تولید با استفاده از مهندسی ژنتیک شده است که امکان تولید این آنزیم در میزبان‌های میکروبی مانند اشریشیا کولی و پیکیا پاستوریس را فراهم می‌کند. پپسین تولید شده به روش نوترکیبی مزایایی مانند یکنواختی، خلوص بالاتر و قابلیت تولید در مقیاس بزرگ‌تر دارد.

برای بهبود پایداری آنزیم، سهولت استفاده مجدد و کنترل بهتر فرآیندهای صنعتی، روش‌های ثابت‌سازی پپسین روی حامل‌های مختلف نیز مورد مطالعه قرار گرفته است. ماتریکس‌های معمول برای این منظور شامل دانه‌های آگاروز، پلیمرهای مصنوعی و نانوذرات مغناطیسی هستند.

 1. کاربردهای پپسین در صنایع غذایی

1.1 تولید پنیر و نقش پپسین در انعقاد شیر

یکی از مهم‌ترین و سنتی‌ترین کاربردهای پپسین در صنعت، نقش حیاتی آن در فرآیند تولید پنیر است. پپسین به‌عنوان یکی از اجزای اصلی ماده‌ای به نام رنت (Rennet) شناخته می‌شود که از معده نشخوارکنندگان استخراج می‌شود. رنت حاوی آنزیمی به نام کیموزین (Chymosin) است که مشابه پپسین فعالیت پروتئولیتیک دارد و در محیط اسیدی شیر تازه، باعث انعقاد آن می‌شود.

در فرآیند تولید پنیر، پپسین با تجزیه پروتئین‌های شیر به‌خصوص کازئین ، ساختار شبکه‌ای ایجاد می‌کند که باعث جدا شدن شیر به دو بخش جامد (پنیر) و مایع (آب پنیر) می‌شود. این انعقاد کنترل‌شده، کیفیت نهایی پنیر را تعیین می‌کند و در تولید انواع مختلف پنیر مثل پنیر چدار، موزارلا و پنیر پارمزان کاربرد دارد. استفاده از پپسین به دلیل فعالیت در pH پایین، باعث می‌شود که فرآیند انعقاد سریع و با دقت بالایی انجام شود و در نتیجه محصول نهایی با کیفیت و بافت مناسب تولید گردد.

همچنین، امروزه با پیشرفت تکنولوژی، پپسین به صورت صنعتی و با فرایندهای خالص‌سازی پیشرفته تولید می‌شود که به کنترل بهتر کیفیت پنیر و کاهش هزینه‌های تولید کمک شایانی کرده است.

1.2 فرآوری گوشت و پروتئین‌ها

پپسین در صنایع فرآوری گوشت نیز کاربردهای گسترده‌ای دارد. این آنزیم قادر است پروتئین‌های پیچیده موجود در بافت‌های گوشت را به پپتیدهای کوتاه‌تر و آمینو اسیدهای قابل جذب تجزیه کند. این ویژگی برای نرم کردن گوشت‌های سخت و بهبود قابلیت هضم آن‌ها بسیار مفید است.

علاوه بر این، در تولید محصولات گوشتی فرآوری‌شده مانند سوسیس، کالباس و همبرگر، پپسین می‌تواند به عنوان یک ماده کمک فرآیندی عمل کند که باعث بهبود طعم، بافت و ماندگاری محصول نهایی می‌شود. استفاده از پپسین در این فرآیندها همچنین امکان کاهش استفاده از مواد افزودنی شیمیایی را فراهم می‌آورد که از نظر سلامت مصرف‌کنندگان مطلوب است.

1.3 کاربرد در تولید مکمل‌های پروتئینی

در صنعت تولید مکمل‌های غذایی و پروتئینی، پپسین نقش مهمی در تهیه هیدرولیزات‌های پروتئینی دارد. این هیدرولیزات‌ها مجموعه‌ای از پپتیدها و آمینو اسیدهای آزاد هستند که از طریق تجزیه کنترل‌شده پروتئین‌ها به دست می‌آیند.

هیدرولیزات‌های پروتئینی به علت سرعت جذب بالا و قابلیت هضم آسان‌تر، در تولید مکمل‌های ورزشی، محصولات تغذیه‌ای برای بیماران خاص، و محصولات نوزادان استفاده می‌شوند. پپسین، با فعالیت در شرایط اسیدی، امکان تولید این هیدرولیزات‌ها را بدون تخریب کامل پروتئین‌ها فراهم می‌کند و به این ترتیب ترکیبات مفید و مطلوب برای جذب سریع را حفظ می‌نماید.

2. کاربردهای پپسین در صنایع دارویی و پزشکی

2.1 استفاده در تهیه داروها و فرمولاسیون‌های درمانی

پپسین در صنعت داروسازی به عنوان یک آنزیم گوارشی در فرمولاسیون‌های دارویی مورد استفاده قرار می‌گیرد. این آنزیم در تولید کپسول‌ها و قرص‌هایی که به هضم پروتئین‌ها کمک می‌کنند، کاربرد دارد و به بیماران دارای اختلالات گوارشی مانند کمبود آنزیم‌های معده کمک می‌کند.

همچنین، پپسین در تهیه داروهای موضعی و ترکیبات ترمیمی پوست نقش دارد؛ به این صورت که با تجزیه پروتئین‌های مرده و آسیب‌دیده، به فرایند ترمیم زخم‌ها و بازسازی بافت کمک می‌کند. این کاربردها در تولید پمادها و پانسمان‌های پیشرفته استفاده می‌شوند.

2.2 نقش پپسین در فرآوری داروهای بیولوژیک

در حوزه بیوتکنولوژی پزشکی، پپسین به عنوان یک ابزار برای فرآوری پروتئین‌ها و پپتیدهای دارویی اهمیت دارد. این آنزیم برای تولید پپتیدهای درمانی، واکسن‌ها و آنتی‌بادی‌های مهندسی‌شده کاربرد دارد. با کمک پپسین، پروتئین‌های بزرگ به قطعات کوچکتر و فعال تقسیم می‌شوند که در ساختارهای دارویی نقش مهمی دارند.

به عنوان مثال، در تولید برخی داروهای آنتی‌بادی مونوکلونال، از پپسین برای ایجاد قطعات Fab استفاده می‌شود که قادرند به طور خاص به آنتی‌ژن هدف متصل شوند. این فرایند، با دقت و کنترل بالا، امکان تهیه داروهای دقیق و موثر را فراهم می‌سازد.

3. کاربردهای پپسین در صنعت چرم و نساجی

پپسین در صنعت چرم‌سازی و نساجی به عنوان یک آنزیم پروتئولیتیک برای حذف پروتئین‌های زائد و افزایش کیفیت محصول نهایی به کار می‌رود. در فرآیند دباغی پوست حیوانات، استفاده از پپسین باعث نرم شدن پوست و حذف مواد نامطلوب می‌شود که نتیجه آن تولید چرم نرم‌تر و با کیفیت‌تر است.

در صنعت نساجی، پپسین به منظور بهبود خواص الیاف طبیعی مانند پشم و ابریشم، و افزایش قابلیت رنگ‌پذیری و نرمی پارچه‌ها استفاده می‌شود. کاربرد این آنزیم باعث کاهش مصرف مواد شیمیایی مضر و ارتقاء فرایندهای زیست‌محیطی می‌گردد.

4. کاربردهای پپسین در بازیابی مواد و صنعت عکاسی

در صنعت بازیابی مواد، پپسین به عنوان یک عامل کمک‌کننده در فرآیند بازیافت پروتئین‌ها و استخراج مواد ارزشمند از پساب‌های صنعتی کاربرد دارد. همچنین، در صنعت عکاسی سنتی، پپسین به عنوان یک آنزیم کمک‌کننده در فرآیندهای تثبیت فیلم‌ها و پاکسازی مواد آلی از سطوح عکاسی استفاده شده است.

با توجه به کاهش کاربرد عکاسی سنتی، استفاده از پپسین در این حوزه محدود شده اما در بازیافت مواد پروتئینی از ضایعات صنعتی هنوز نقش قابل توجهی دارد.

5. روش‌های نوین تولید و بهینه‌سازی عملکرد پپسین در صنعت

5.1 تولید نوترکیبی و مهندسی ژنتیک

با پیشرفت‌های بیوتکنولوژی، تولید پپسین به روش نوترکیبی و مهندسی ژنتیک در سیستم‌های میکروبی بسیار رایج شده است. این روش‌ها امکان تولید آنزیم‌های با خلوص بالا، عملکرد بهینه و قابلیت تغییر خصوصیات آنزیم مانند افزایش پایداری در شرایط صنعتی را فراهم می‌کنند.

تولید پپسین نوترکیبی در میزبان‌هایی مانند باکتری اشریشیا کولی و مخمر پیکیا پاستوریس باعث کاهش هزینه‌ها، افزایش بازده و کنترل بهتر کیفیت محصول شده است.

5.2 تثبیت و ایموبیلیزاسیون آنزیم

برای افزایش ماندگاری و استفاده مجدد از پپسین در فرایندهای صنعتی، روش‌های تثبیت و ایموبیلیزاسیون آنزیم توسعه یافته‌اند. در این روش‌ها، پپسین روی مواد جامد مانند رزین‌های پلیمری، نانوذرات مغناطیسی و ژل‌های طبیعی یا مصنوعی تثبیت می‌شود.

این تکنیک‌ها باعث افزایش پایداری آنزیم در برابر شرایط نامساعد، کاهش هزینه‌های فرایندی و امکان استفاده پیوسته در راکتورها و سیستم‌های جریان پیوسته می‌شوند.

6. مزایا و محدودیت‌های استفاده از پپسین در صنعت

مزایا:

• فعالیت در شرایط اسیدی: پپسین عملکرد بهینه در pH پایین دارد که در برخی فرایندهای صنعتی بسیار مطلوب است.

• اختصاصی بودن: این آنزیم بر روی پیوندهای خاص پپتیدی کار می‌کند که کنترل دقیق بر روی فرایند هیدرولیز را ممکن می‌سازد.

• تنوع کاربرد: پپسین در صنایع متنوعی از جمله غذایی، دارویی، چرم‌سازی و بازیابی مواد کاربرد دارد.

• قابلیت تولید نوترکیبی: امکان تولید با کیفیت و کمیت بالا از طریق مهندسی ژنتیک.

محدودیت‌ها:

• حساسیت به دما و pH: پپسین در شرایط غیر از اسیدی و دمای بالا به سرعت غیرفعال می‌شود.

• عدم پایداری طولانی مدت: بدون تثبیت مناسب، پپسین نمی‌تواند در فرایندهای طولانی مدت صنعتی به کار رود.

• تاثیرات احتمالی آلرژیک: استفاده از پپسین استخراج شده از منابع حیوانی ممکن است در برخی افراد حساسیت ایجاد کند.

• هزینه‌های تولید: تولید و خالص‌سازی پپسین در مقیاس صنعتی هزینه‌بر است، هرچند با روش‌های نوین این مسئله در حال بهبود است.

تولید و استخراج پپسین صنعتی

فرآیند استخراج پپسین صنعتی، از جمع‌آوری معده حیوانات آغاز می‌شود و پس از مراحل خیساندن در محیط اسیدی، فعال‌سازی، خالص‌سازی و تثبیت، پپسین با کیفیت مطلوب برای کاربردهای صنعتی تهیه می‌گردد. توسعه تکنولوژی‌های نوین مانند تولید آنزیم نوترکیبی و تثبیت آن، افق‌های جدیدی در تولید صنعتی پپسین باز کرده است که هم از لحاظ اقتصادی و هم از نظر کیفیت بسیار مقرون به صرفه‌تر و بهینه‌تر هستند.

۱. منابع پپسین

منبع اصلی استخراج پپسین، معده نشخوارکنندگان مانند گاو و خوک است. این معده‌ها که به‌عنوان ضایعات جانبی کشتارگاه‌ها در نظر گرفته می‌شوند، دارای مقادیر قابل توجهی پپسینوژن (فرم غیر فعال پپسین) هستند. پپسینوژن در شرایط اسیدی معده به پپسین فعال تبدیل می‌شود. به همین دلیل، معده این حیوانات منبع غنی و ارزان برای تهیه پپسین صنعتی محسوب می‌شود.

۲. مراحل استخراج پپسین

۲.۱ جمع‌آوری و آماده‌سازی ماده اولیه

معده‌های تازه پس از کشتار جمع‌آوری می‌شوند و با شستشو با آب سرد و محلول‌های نمکی تمیز می‌گردند تا خون، مخاط و مواد زائد سطحی حذف شود. این مرحله اهمیت زیادی در کیفیت نهایی آنزیم دارد.

۲.۲ استخراج پپسینوژن

در این مرحله، معده‌ها به قطعات کوچک‌تر خرد شده و در محلول اسیدی با pH حدود ۲ (معمولاً با استفاده از اسید کلریدریک یا اسید سولفوریک رقیق) خیسانده می‌شوند. این محیط اسیدی باعث آزادسازی پپسینوژن از بافت معده می‌شود.

۲.۳ فعال‌سازی پپسینوژن به پپسین

پپسینوژن یک زیموژن غیر فعال است که تحت شرایط اسیدی و دمای مناسب (حدود ۳۵–۴۰ درجه سانتی‌گراد) به صورت خودکاتالیز فعال شده و به پپسین تبدیل می‌شود. این مرحله معمولاً با نگهداری محلول استخراج شده به مدت چند ساعت انجام می‌گیرد.

۳. خالص‌سازی پپسین

۳.۱ رسوب‌دهی پروتئین

برای جداسازی پپسین از سایر پروتئین‌ها و مواد محلول، از تکنیک‌های رسوب‌دهی مانند استفاده از نمک آمونیوم سولفات بهره گرفته می‌شود. در این روش، با افزودن آمونیوم سولفات به محلول استخراج، پپسین به صورت رسوب جدا می‌شود.

۳.۲ فیلتراسیون و دیالیز

پس از رسوب‌دهی، محلول حاوی پپسین جمع‌آوری شده و با فیلتراسیون و سپس دیالیز، نمک‌های اضافه و ناخالصی‌های کوچک حذف می‌شوند.

۳.۳ کروماتوگرافی

برای رسیدن به خلوص بالا، از روش‌های کروماتوگرافی نظیر کروماتوگرافی تبادل یونی، ژل فیلتراسیون و کروماتوگرافی فاز معکوس استفاده می‌شود. این روش‌ها امکان جداسازی دقیق‌تر پپسین را فراهم می‌کنند.

۴. فرآوری نهایی و تثبیت

پس از خالص‌سازی، پپسین به شکل‌های مختلفی برای کاربردهای صنعتی آماده می‌شود. این شامل فرم‌های مایع، خشک شده با انجماد (freeze-dried) یا اسپری خشک شده (spray-dried) می‌شود. افزودن مواد نگهدارنده و تثبیت‌کننده به منظور افزایش پایداری آنزیم در طول ذخیره‌سازی نیز معمول است.

۵. تولید پپسین با تکنولوژی نوین (مهندسی ژنتیک)

در دهه‌های اخیر، به منظور رفع محدودیت‌های استخراج از منابع حیوانی و افزایش کیفیت و مقیاس تولید، از تکنیک‌های مهندسی ژنتیک برای تولید پپسین در میزبان‌های میکروبی مانند اشریشیا کولی و مخمرها استفاده شده است. تولید پپسین نوترکیبی مزایای زیادی دارد که از جمله می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

• تولید مداوم و مقیاس‌پذیر با کیفیت و خلوص بالا

• کاهش احتمال آلودگی‌های زیستی و آلرژی‌زا

• امکان اصلاحات ژنتیکی برای بهبود خصوصیات عملکردی آنزیم

• کنترل بهتر بر روی فعالیت آنزیمی و خواص فیزیکی

۶. تثبیت و استفاده صنعتی

برای استفاده در فرایندهای صنعتی، پپسین معمولاً روی حامل‌هایی مانند رزین‌ها یا نانوذرات ثابت می‌شود تا بتوان آن را بازیابی و مجدداً استفاده کرد. این کار باعث افزایش دوام و کاهش هزینه‌های فرآیندی می‌شود.