انواع pcr و کاربرد آنها

فهرست انواع PCR

Amplified fragment length polymorphism (AFLP) PCR
Allele-specific PCR
Alu PCR
Assembly PCR
Asymmetric PCR
COLD PCR
Colony PCR
Conventional PCR
Digital PCR (dPCR)
Fast-cycling PCR
High-fidelity PCR
High-Resolution Melt (HRM) PCR
Hot-start PCR
In situ PCR
Intersequence-specific (ISSR) PCR
Inverse PCR
LATE (linear after the exponential) PCR
Ligation-mediated PCR
Long-range PCR
Methylation-specific PCR (MSP)
Miniprimer PCR
Multiplex-PCR
Nanoparticle-Assisted PCR (nanoPCR)
Nested PCR
Overlap extension PCR
Real-Time PCR (quantitative PCR or qPCR)
Repetitive sequence-based PCR
Reverse-Transcriptase (RT-PCR)
Reverse-Transcriptase Real-Time PCR (RT-qPCR)
RNase H-dependent PCR (rhPCR)
Single cell PCR
Single Specific Primer-PCR (SSP-PCR)
Solid phase PCR
Suicide PCR
Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)
Touch down (TD) PCR
Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR

1.پلی‌مورفیسم طولی قطعات تکثیرشده (AFLP PCR)

1. تعریف تکنیک AFLP PCR

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بر اساس پلی‌مورفیسم طول قطعه تقویت‌شده (AFLP PCR)، تکنیکی مبتنی بر PCR است.
این روش از تقویت انتخابی بخشی از قطعات DNA هضم‌شده استفاده می‌کند تا اثر انگشت ژنتیکی (fingerprint) منحصربه‌فردی برای ژنوم‌های مورد نظر ایجاد کند.

2. مزایا و ویژگی‌ها

این تکنیک می‌تواند به‌سرعت تعداد زیادی نشانگر ژنتیکی برای هر موجود زنده تولید کند.
نیازی به دانش قبلی از توالی ژنومی ندارد.

3. مراحل انجام تکنیک

هضم DNA ژنومی:
استفاده از آنزیم‌های محدودکننده برای برش DNA.
اتصال آداپتورها:
اتصال آداپتورها به انتهای چسبنده قطعات DNA حاصل از هضم.
انتخاب و تقویت قطعات:
انتخاب بخشی از قطعات برای تقویت با استفاده از آغازگرهایی که مکمل توالی آداپتورها هستند.
جدا‌سازی و مشاهده:
جداسازی توالی‌های تقویت‌شده از طریق الکتروفورز ژل آگارز دناتوره‌شونده و مشاهده آن‌ها.

4. کاربردها

ارزیابی تنوع ژنتیکی درون گونه‌ای یا بین گونه‌های نزدیک.
استنتاج تبارزایی (فیلوژنی) در سطح جمعیت و بررسی الگوهای زیست‌جغرافیایی.
تولید نقشه‌های ژنتیکی.
تعیین میزان خویشاوندی میان ارقام و واریته‌های مختلف.

2. Allele-specific PCR

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز اختصاصی آلل (AS-PCR) تکنیکی است که بر پایه استفاده از آغازگرهای اختصاصی برای آلل طراحی شده و برای بررسی پلی‌مورفیسم تک‌نوکلئوتیدی (SNP) کاربرد دارد.
این تکنیک همچنین با نام سیستم جهش مقاوم به تقویت (ARMS-PCR) نیز شناخته می‌شود که در آن از دو آغازگر متفاوت برای دو آلل مختلف استفاده می‌شود.
یکی از این مجموعه آغازگرها مختص آلل جهش‌یافته است که به واکنش PCR نرمال مقاوم (refractory) است، و مجموعه دیگر مختص آلل نرمال است که نسبت به واکنش PCR جهش‌یافته مقاوم است.
انتهای ۳' این آغازگرها به‌گونه‌ای تغییر داده شده که یک مجموعه قادر به تقویت (آمپلیفای) آلل نرمال باشد، در حالی که مجموعه دیگر فقط آلل جهش‌یافته را تقویت می‌کند.
این عدم تطابق در انتهای آغازگرها، امکان شناسایی و تقویت اختصاصی یک آلل خاص را فراهم می‌کند.

4. کاربردها

شناسایی جهش نقطه‌ای ژن‌های خاص مانند:
- بیماری آنمی داسی‌شکل (Sickle Cell Anemia)
- بیماری تالاسمی (Thalassemia)
تعیین مستقیم ژنوتیپ گروه خونی ABO

Alu PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز مبتنی بر عناصر Alu)
Alu PCR یک تکنیک سریع و ساده برای اثر انگشت‌برداری ژنتیکی (DNA fingerprinting) است که بر پایه تحلیل هم‌زمان نواحی متعدد ژنومی انجام می‌شود؛ این نواحی، توسط توالی‌های تکراری Alu احاطه شده‌اند.

عناصر Alu بخش‌های کوتاهی از DNA هستند که برای اولین بار از طریق عملکرد آنزیم محدودکننده Arthrobacter luteus (که مخفف آن همان "Alu" است) شناسایی شدند.
این عناصر یکی از فراوان‌ترین عناصر قابل‌انتقال (transposable elements) در ژنوم انسان هستند. آن‌ها در سراسر ژنوم پراکنده‌اند و نقش مهمی در تکامل ژنوم انسان ایفا کرده‌اند و همچنین به‌عنوان نشانگرهای ژنتیکی (genetic markers) مورد استفاده قرار می‌گیرند.

در تکنیک Alu PCR، از دو آغازگر (primer) دارای برچسب فلورسانس (فلوروکروم) استفاده می‌شود که مکمل توالی‌های موجود در نزدیکی عناصر Alu هستند.
این آغازگرها در واکنش PCR به نواحی خاصی از DNA متصل شده و پس از تقویت (آمپلیفیکیشن)، محصولات PCR مورد تجزیه و تحلیل قرار می‌گیرند (معمولاً توسط الکتروفورز یا توالی‌یابی فلورسانس).

درج‌های Alu (Alu insertions) در بسیاری از بیماری‌های ارثی انسانی و انواع مختلف سرطان‌ها شناسایی شده‌اند.
بنابراین، Alu PCR در تشخیص این بیماری‌ها و جهش‌های مرتبط نقش بسیار مهم و کاربردی دارد.

اطلاعات تکمیلی:

عناصر Alu متعلق به خانواده SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) هستند و حدود ۱۰ درصد از ژنوم انسان را تشکیل می‌دهند.
هر عنصر Alu تقریباً ۳۰۰ جفت باز (bp) طول دارد و توانایی تکثیر و پراکندگی در ژنوم را دارد.
به دلیل حضور فراوان و توزیع گسترده، این عناصر در تکامل و تنوع ژنتیکی نقش دارند و در برخی موارد باعث اختلال در عملکرد ژن‌ها یا ایجاد جهش‌های بیماری‌زا می‌شوند.
در مطالعات ژنتیکی انسان‌شناسی (anthropological genetics)، Alu PCR برای ردیابی اجداد ژنتیکی و مهاجرت‌های انسانی نیز استفاده شده است.
تکنیک Alu-PCR همچنین در تحلیل‌های forensic (پزشکی قانونی) و تعیین هویت افراد کاربرد دارد.

Assembly PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز مونتاژی)
Assembly PCR یا PCR مونتاژی، یک روش تخصصی برای مونتاژ (ساختن) توالی‌های بلند DNA از چندین قطعه‌ی کوتاه‌تر DNA (الیگونوکلئوتید) است.
در حالی که در روش‌های معمول PCR از الیگونوکلئوتیدهایی با طول حدود ۱۸ جفت باز استفاده می‌شود، در Assembly PCR معمولاً از الیگونوکلئوتیدهایی با طول تا ۵۰ جفت باز استفاده می‌شود تا اطمینان حاصل شود که اتصال و هیبریداسیون دقیق بین قطعات انجام می‌شود.

در طول چرخه‌های PCR، این الیگونوکلئوتیدها به قطعات مکمل خود متصل می‌شوند و سپس آن‌ها توسط آنزیم پلیمراز پر و تکمیل می‌شوند.
در هر چرخه‌ی این PCR، طول قطعات مختلف DNA به‌صورت تصادفی اما تدریجی افزایش می‌یابد، بسته به این‌که کدام الیگونوکلئوتیدها یکدیگر را پیدا کنند و با هم جفت شوند.

این فرآیند به‌گونه‌ای طراحی شده که در نهایت توالی کامل و بلند هدف که از قبل طراحی شده، ساخته می‌شود.

از Assembly PCR می‌توان برای افزایش بازده تولید پروتئین هدف استفاده کرد؛ به‌ویژه زمانی که بخواهیم ژن‌های مصنوعی را طراحی کرده و بیان کنیم.
همچنین این روش برای تولید مقادیر زیادی از RNA در مطالعات ساختاری یا بیوشیمیایی کاربرد دارد؛ برای مثال در بررسی ساختار RNA یا سنتز RNAهای غیرطبیعی (synthetic RNAs).

اطلاعات علمی تکمیلی:

این تکنیک بخشی از حوزه‌ی سنتز ژن مصنوعی (de novo gene synthesis) محسوب می‌شود، یعنی ساخت کامل یک ژن بدون نیاز به منبع طبیعی.
از آن‌جایی‌که می‌توان توالی دلخواه را از ابتدا طراحی کرد، این روش در مهندسی ژنتیک، زیست‌فناوری و ساخت پروتئین‌های نوترکیب بسیار کاربرد دارد.
در برخی پروژه‌ها مانند ساخت واکسن‌های DNA، آنتی‌بادی‌های مهندسی‌شده، و حتی ژن‌درمانی از Assembly PCR به‌عنوان مرحله‌ای کلیدی استفاده می‌شود.
مونتاژ موفق نیاز به طراحی دقیق دارد: الیگونوکلئوتیدها باید به‌گونه‌ای طراحی شوند که دارای همپوشانی (overlap) مناسب با قطعات مجاور باشند، تا پلیمراز بتواند بین آن‌ها پلی بزند.
در مراحل بعد از PCR مونتاژی، معمولاً از یک PCR تکمیلی (extension PCR) برای تکثیر محصول نهایی استفاده می‌شود.

Asymmetric PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز نامتقارن)
PCR نامتقارن (Asymmetric PCR) یکی از انواع تغییریافته‌ی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) است که برای تقویت ترجیحی یکی از رشته‌های DNA دو رشته‌ای اولیه نسبت به رشته‌ی مکمل آن طراحی شده است.

تفاوت اصلی بین PCR نامتقارن و PCR معمولی در این است که در PCR نامتقارن، از مقدار بیشتری از آغازگر (primer) برای یک رشته‌ی خاص استفاده می‌شود، در حالی که آغازگر مکمل آن با غلظت بسیار کمتری به واکنش اضافه می‌گردد.

با پیشرفت واکنش PCR، آغازگری که با غلظت پایین‌تری به واکنش افزوده شده است (آغازگر محدودکننده)، به‌صورت کامل در ساخت DNA دو رشته‌ای جدید مصرف می‌شود و عملاً از واکنش حذف می‌شود.

در نتیجه، پس از مصرف کامل آغازگر محدود، تقویت یا سنتز به‌صورت خطی (نه نمایی) و تنها برای رشته‌ای ادامه می‌یابد که آغازگر آن به‌صورت مازاد در واکنش وجود دارد. به این ترتیب، فقط یکی از دو رشته‌ی DNA به شکل چشمگیری افزایش می‌یابد.

این روش زمانی مفید است که تنها تقویت یکی از دو رشته‌ی مکمل DNA مورد نیاز باشد، مانند:

توالی‌یابی (DNA Sequencing)
پروب‌گذاری در تکنیک‌های هیبریداسیون (Hybridization Probing) مثل Northern blot یا Southern blot
تولید پروب‌های تک‌رشته‌ای DNA
و حتی در روش‌های تشخیص مبتنی بر DNA مثل microarray یا biosensorها

اطلاعات علمی تکمیلی:

PCR نامتقارن در تکنیک‌هایی که به DNA تک‌رشته‌ای نیاز دارند بسیار حیاتی است، چرا که در بسیاری از سیستم‌های آنالیز ژنتیکی یا زیست‌مولکولی، رشته‌ی مکمل فقط باعث ایجاد نویز یا مزاحمت می‌شود.
در روش‌های تشخیصی، تولید تک‌رشته‌های DNA به‌صورت هدفمند می‌تواند دقت شناسایی را بالا ببرد.
برخلاف PCR معمولی که محصول آن دو رشته مکمل است (double-stranded DNA)، محصول نهایی PCR نامتقارن عمدتاً DNA تک‌رشته‌ای (ssDNA) است.
به‌طور معمول، نسبت آغازگرها در این تکنیک به‌صورت ۱:۵ یا حتی ۱:۱۰ (محدودکننده به مازاد) طراحی می‌شود.
اگرچه راندمان نهایی ممکن است نسبت به PCR معمولی کمتر باشد، اما مزیت این روش در تولید انتخابی رشته‌ی هدف است.
در ترکیب با تکنیک‌هایی مانند qPCR با پروب یا الکتروفورز RNA, این روش ارزش تحلیلی بالایی دارد.

COLD-PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با دناتوراسیون در دمای پایین)
COLD-PCR که مخفف Co-amplification at Lower Denaturation temperature-PCR است، شکلی نوین و بهینه‌شده از تکنیک PCR به شمار می‌رود که هدف آن، تقویت انتخابی و حساس DNAهای دارای جهش (یا واریانت‌های نادر) در میان مخلوطی از توالی‌های نوع وحشی (Wild-type) و جهش‌یافته است؛ بدون توجه به نوع جهش یا محل قرارگیری آن در آمپلیکون (قطعه هدف).

در این روش، اصل عملکرد بر پایه‌ی تغییر دمای بحرانی دناتوراسیون است؛ یعنی دمایی که در آن، DNA دارای جهش به‌طور ترجیحی نسبت به DNA نوع وحشی باز می‌شود (Denature می‌شود).
در طی چرخه‌های PCR، یک مرحله‌ی میانی اتصال (Annealing) پس از دناتوراسیون قرار داده می‌شود. در این مرحله، رشته‌های نوع وحشی و جهش‌یافته می‌توانند به یکدیگر متصل شده و هترودوپلکس (heteroduplex) تشکیل دهند.

این هترودوپلکس‌ها (ترکیب رشته‌های مکمل غیردقیق) دارای دمای ذوب (Tm) متفاوتی هستند و به‌راحتی در دمای خاصی دناتوره می‌شوند. بنابراین، این ساختارها به‌عنوان قالب (template) در PCR استفاده شده و نسبت به نوع وحشی، بیشتر تقویت می‌شوند.

در نتیجه، با استفاده از COLD-PCR، بخش‌های اندک واریانت یا DNA جهش‌یافته در نمونه، به‌طور اختصاصی و مؤثر تقویت می‌گردند و می‌توانند در مراحل بعدی PCR یا آنالیز مولکولی مورد استفاده قرار گیرند.

اطلاعات علمی تکمیلی:

COLD-PCR به‌ویژه در نمونه‌های بالینی دارای محتوای جهش کم (Low-frequency mutations) کاربرد حیاتی دارد، جایی که روش‌های PCR معمولی قادر به تشخیص این جهش‌ها نیستند.
از مهم‌ترین کاربردهای این روش، می‌توان به تشخیص جهش‌های مرتبط با سرطان در نمونه‌های توموری ناهمگن (Heterogeneous Tumors) یا در مایعات بدن مانند خون، سرم، پلاسما یا مایع نخاعی اشاره کرد.
این تکنیک در پایش بیماری باقی‌مانده (Minimal Residual Disease) بعد از جراحی یا شیمی‌درمانی کاربرد دارد، و در مرحله‌بندی بیماری و پروفایل‌سازی مولکولی تومورها برای پیش‌آگهی یا تعیین درمان اختصاصی برای هر بیمار نقش مهمی دارد.
COLD-PCR معمولاً با روش‌هایی مانند Sanger Sequencing، qPCR یا Next Generation Sequencing (NGS) ترکیب می‌شود تا قدرت تشخیص جهش‌های نادر به طرز چشمگیری افزایش یابد.

Colony PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز از کلنی باکتریایی)
Colony PCR یک روش ساده و سریع در زیست‌فناوری مولکولی است که در آن شناسایی DNA مورد نظر که به پلاسمید وارد شده است (Insert DNA)، از طریق طراحی آغازگرهای اختصاصی برای توالی واردشده انجام می‌گیرد.

در این روش، از کلنی باکتریایی حاوی پلاسمید می‌توان به‌صورت مستقیم برای انجام PCR استفاده کرد؛ یعنی بدون نیاز به استخراج DNA پلاسمیدی.

برای انجام PCR از دو دسته آغازگر (Primer) استفاده می‌شود:

آغازگرهای اختصاصی برای توالی وارد شده (Insert-specific primers): این آغازگرها توالی DNA واردشده را تقویت می‌کنند.
آغازگرهای خاص ناحیه بردار (Vector-specific flanking primers): این دسته از آغازگرها نواحی اطراف توالی وارد شده را که مربوط به پلاسمید اصلی هستند، تقویت می‌کنند.

برای انجام واکنش، یک کلنی باکتری از محیط کشت برداشته شده و به‌صورت مستقیم در داخل مسترمیکس PCR (حاوی همه مواد مورد نیاز واکنش) اضافه می‌شود. سپس چرخه‌های PCR طبق برنامه ادامه پیدا می‌کنند.

کاربرد اصلی Colony PCR در بررسی و تایید درستی اتصال (Ligation) و درج موفق توالی هدف در داخل پلاسمیدهای باکتریایی یا حتی پلاسمیدهای مخمر (yeast plasmids) است. این تکنیک برای غربالگری تعداد زیادی کلنی پس از کلونینگ بسیار پرکاربرد و ضروری است.

اطلاعات علمی تکمیلی:

برای موفقیت در Colony PCR، معمولاً یک مرحله حرارت‌دهی اولیه برای لیز کردن دیواره باکتری و آزادسازی DNA انجام می‌شود (مثلاً در 94–95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه).
در برخی موارد از آنزیم لیزوزیم یا بافرهای خاص برای افزایش کارایی لیز کردن سلول نیز استفاده می‌شود.
این تکنیک به طور گسترده در مراحل اولیه کلونینگ ژنی، ارزیابی ساختارهای نوترکیب و بررسی موفقیت اتصال ژن به وکتور استفاده می‌شود.
معمولاً پس از PCR، محصولات روی ژل آگارز الکتروفورز می‌شوند تا حضور باند مربوط به توالی وارد شده تأیید گردد.
این روش نسبت به استخراج DNA، سریع‌تر، ارزان‌تر و مناسب برای بررسی تعداد زیادی نمونه به‌صورت هم‌زمان است.

🔬 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز متداول (Conventional PCR)

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز یا PCR (Polymerase Chain Reaction) یک روش آزمایشگاهی است که در لوله آزمایش (in vitro) انجام می‌شود و به عنوان یک سیستم شبیه‌سازی فرآیند همانندسازی DNA عمل می‌کند. این تکنیک به ما امکان می‌دهد که یک توالی خاص از DNA هدف را در مدت زمانی کوتاه (چند ساعت)، به طور انتخابی میلیون‌ها بار تکثیر کنیم.

در این فرآیند، از آنزیمی به نام DNA پلیمراز استفاده می‌شود که همان آنزیمی است که در درون سلول‌ها نیز وظیفه تکثیر ماده ژنتیکی را برعهده دارد. عملکرد اصلی این آنزیم سنتز رشته‌ی مکمل DNA است، که این کار را با استفاده از یک آغازگر (primer) انجام می‌دهد. آغازگر یک قطعه کوتاه از نوکلئوتیدهاست که به نقطه‌ای خاص روی یکی از رشته‌های DNA متصل می‌شود و آن محل را برای شروع سنتز تعیین می‌کند.

آغازگرها محدوده‌ی خاصی از DNA را مشخص می‌کنند که باید تکثیر شود، و در نتیجه فقط همان بخش هدف DNA با استفاده از آنزیم، نوکلئوتیدها و سیکل‌های حرارتی، میلیاردها نسخه تولید می‌کند. این فرآیند از سه مرحله حرارتی اصلی تشکیل شده است:

دناتوراسیون (دمای بالا - جداسازی دو رشته DNA)
اتصال آغازگرها (Annealing - دمای پایین‌تر)
طویل‌سازی یا گسترش (Extension - دمای مناسب فعالیت آنزیم)

کاربردهای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز سنتی

جداسازی انتخابی DNA (Selective DNA isolation)
تکثیر (Amplification) و سنجش مقدار DNA (Quantification)
کاربردهای پزشکی و تشخیصی (Medical and diagnostic approaches)
تشخیص بیماری‌های عفونی (Infectious disease diagnosis)
مطالعات پزشکی قانونی (Forensic studies)
تحقیقات علمی در حوزه‌های مختلف زیست‌شناسی مولکولی، ژنتیک و بیوتکنولوژی

9. Digital PCR (dPCR)

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز دیجیتال (Digital PCR یا dPCR) یک فناوری کمی (Quantitative) از PCR است که روشی بسیار حساس و کارآمد برای اندازه‌گیری دقیق مقدار DNA یا RNA موجود در یک نمونه فراهم می‌کند.

در روش dPCR، ابتدا مخلوط اولیه‌ی نمونه به تعداد زیادی چاهک یا واکنشگاه مجزا تقسیم می‌شود، پیش از آنکه مرحله‌ی تکثیر (Amplification) آغاز گردد. در این تقسیم‌بندی، در هر چاهک یا واکنشگاه، یا توالی هدف (Target sequence) حضور دارد یا ندارد.

پس از انجام واکنش PCR، با توجه به حضور یا عدم حضور سیگنال فلورسانس در چاهک‌ها، می‌توان تعداد دقیق توالی‌های هدف موجود در نمونه‌ی اولیه را محاسبه کرد. چاهک‌هایی که سیگنال فلورسانس نشان می‌دهند، مثبت در نظر گرفته شده و با عدد "1" علامت‌گذاری می‌شوند؛ در حالی که چاهک‌های فاقد سیگنال، منفی تلقی شده و با عدد "0" مشخص می‌شوند.

در مرحله بعد، برای تعیین غلظت واقعی توالی هدف در نمونه اولیه، از تحلیل آماری پواسون (Poisson statistical analysis) استفاده می‌شود. این تحلیل، بر مبنای احتمال توزیع تصادفی مولکول‌ها در واکنشگاه‌ها، تعداد واقعی مولکول‌ها را با دقت بالا محاسبه می‌کند.

dPCR به طور گسترده‌ای برای تعیین تعداد کل ویروس‌های DNA و RNA، باکتری‌ها و انگل‌ها در انواع نمونه‌های بالینی استفاده می‌شود. این روش به‌ویژه زمانی مفید است که استاندارد کالیبره‌شده دقیقی در دسترس نباشد.

از دیگر مزایای مهم این روش می‌توان به توانایی شناسایی و کمّی‌سازی واریانت‌های ژنتیکی نادر (rare variants)، حساسیت بالا در تشخیص جهش‌های کم‌تعداد در توده‌های سلولی (مثل تومورها)، و کاربرد در آزمایش‌های غیرتهاجمی مانند cfDNA در نمونه‌های خون اشاره کرد. همچنین در زمینه‌هایی مانند مطالعات سرطان، بیماری‌های عفونی، ژنتیک انسانی و حتی کشاورزی مولکولی (برای شناسایی موجودات تراریخته یا ویروس‌های گیاهی)، کاربرد گسترده‌ای دارد.

10. Fast cycling PCR

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با چرخه سریع (Fast Cycling PCR)، یکی از فناوری‌های مبتنی بر PCR است که امکان تکثیر سریع محصولات خاص PCR را با زمان چرخه‌ای به‌مراتب کمتر فراهم می‌سازد.

اصل عملکرد در این روش دقیقاً مشابه PCR سنتی است، با این تفاوت که زمان انجام چرخه‌ها (دناتوراسیون، اتصال آغازگر و امتداد) در این تکنیک بسیار کوتاه‌تر است. به‌عبارت دیگر، واکنش‌های تکثیر DNA با سرعت بیشتری نسبت به PCR معمولی انجام می‌شود، در حالی که کیفیت و صحت تکثیر همچنان حفظ می‌گردد.

در این روش از بافرهای مخصوصی استفاده می‌شود که تمایل آنزیم Taq DNA polymerase را برای اتصال به قطعات کوتاه تک‌رشته‌ای DNA (ssDNA) افزایش می‌دهند. این ویژگی باعث می‌شود زمان موردنیاز برای اتصال آغازگر (Primer Annealing) تنها به حدود ۵ ثانیه کاهش یابد، که در مقایسه با PCR سنتی بسیار سریع‌تر است.

Fast Cycling PCR به‌ویژه در مواردی کاربرد دارد که سرعت فرآیند تکثیر اهمیت زیادی دارد؛ مانند:

تشخیص سریع بیماری‌های عفونی
شناسایی فوری جهش‌های ژنتیکی یا موتاسیون‌ها
واکنش‌های فوری در آزمایشگاه‌های بالینی یا اورژانس‌های پزشکی
افزایش راندمان آزمایش‌های با تعداد زیاد نمونه

از آن‌جایی که کاهش زمان انجام PCR می‌تواند در تحقیقات مولکولی، تست‌های ژنتیکی پزشکی، غربالگری‌های گسترده و نیز توسعه کیت‌های تشخیصی بسیار مؤثر واقع شود، این تکنیک به‌عنوان یک ابزار کاربردی و سریع در زیست‌شناسی مولکولی و ژنتیک شناخته می‌شود.

11. PCR با دقت بالا (High Fidelity PCR)
PCR با دقت بالا یک روش اصلاح‌شده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز است که در آن از آنزیم DNA پلیمراز با نرخ خطای بسیار پایین استفاده می‌شود. نتیجه این تکنیک، تکثیر بسیار دقیق و قابل اعتماد DNA هدف در طول فرآیند PCR است.

آنزیم‌های مورد استفاده در High-Fidelity PCR دارای تمایل پیوندی بالا برای نوکلئوتید صحیح (نوکلئوزید تری‌فسفات مناسب) در حین تکثیر هستند. اگر یک نوکلئوتید اشتباه در جایگاه فعال آنزیم قرار گیرد، به دلیل ساختار خاص و دقیق جایگاه فعال، فرآیند الحاق (incorporation) کند شده یا متوقف می‌شود. به این ترتیب احتمال بروز خطا در تکثیر DNA به شدت کاهش می‌یابد.

از آنجایی که دقت در توالی DNA در بسیاری از آزمایش‌ها اهمیت حیاتی دارد، استفاده از High-Fidelity PCR در موارد زیر ضروری است:

کلون‌سازی دقیق ژن‌ها
تحلیل پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی (SNP)
برنامه‌های تعیین توالی نسل جدید (NGS)
بیان ژن و بررسی جهش‌های نادر

به طور خلاصه، در هر آزمایشی که صحت توالی DNA نقش کلیدی ایفا کند، از این روش استفاده می‌شود تا نتایج قابل اعتماد و دقیق‌تری حاصل شود.

12. High-Resolution Melt (HRM) PCR

(HRM-PCR) یک تکنیک بسیار قدرتمند برای شناسایی جهش‌ها، پلی‌مورفیسم‌ها و تفاوت‌های اپی‌ژنتیکی در نمونه‌های DNA دو رشته‌ای است.

این روش در مقایسه با فناوری‌های ژنوتایپینگ دیگر مانند تعیین توالی (Sequencing) و تایپینگ SNP با استفاده از تکنولوژی TaqMan بسیار مقرون‌به‌صرفه‌تر است، که آن را به گزینه‌ای ایده‌آل برای پروژه‌های ژنوتایپینگ در مقیاس بالا تبدیل می‌کند.

ویژگی‌های کلیدی HRM-PCR شامل موارد زیر است:

سرعت بالا: می‌تواند در مدت زمان کوتاهی تعداد بسیار زیادی نمونه را ژنوتایپ کند.
دقت بالا: تفاوت‌های حتی بسیار جزئی در توالی DNA را شناسایی می‌کند.
سادگی انجام: در صورتی که آزمایش HRM با کیفیت طراحی شده باشد، افراد بدون تخصص در ژنتیک نیز می‌توانند آن را در هر آزمایشگاهی که دستگاه Real-Time PCR با قابلیت HRM در اختیار دارد، انجام دهند.

در این روش، پس از انجام PCR، از تغییرات فلورسانس در طی ذوب تدریجی محصولات PCR استفاده می‌شود تا تفاوت‌های موجود در توالی DNA آشکار شود. تغییر در نقطه ذوب DNA معمولاً نشان‌دهنده جهش یا تفاوت اپی‌ژنتیکی است.

در مجموع، HRM-PCR به‌دلیل سادگی، هزینه کم، دقت و سرعت بالا، به یکی از پرکاربردترین ابزارها در زمینه ژنتیک مولکولی، مطالعات جمعیت، اپی‌ژنتیک و پزشکی شخصی تبدیل شده است.

13. Hot start PCR

Hot start PCR یک شکل نوین از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) متداول است که با هدف کاهش تشکیل محصولات ناخواسته و دایمرهای پرایمر طراحی شده است. این مشکلات اغلب در دماهای اتاق به دلیل تکثیر غیر اختصاصی DNA اتفاق می‌افتند، به ویژه زمانی که واکنش هنوز به دمای دناتوراسیون نرسیده است.

اصل بنیادی در Hot Start PCR، جدا نگه داشتن یک یا چند جزء از مخلوط واکنش تا زمانی است که دمای مخلوط به دمای دناتوراسیون (معمولاً حدود ۹۴–۹۵ درجه سانتی‌گراد) برسد. این جدا‌سازی می‌تواند به صورت فیزیکی (مثلاً با استفاده از واکنش‌دهنده‌هایی که به حرارت فعال می‌شوند) یا شیمیایی (با استفاده از آنزیم‌هایی که در دمای پایین غیرفعال هستند) انجام شود.

در این نوع PCR، تا زمانی که مخلوط به دمای لازم نرسیده باشد، آنزیم پلیمراز یا فعال نمی‌شود یا در دسترس نخواهد بود. به همین دلیل، واکنش‌های غیر اختصاصی که معمولاً در دمای پایین و پیش از شروع چرخه‌های حرارتی رخ می‌دهند، به طور مؤثر مهار می‌شوند.

مزایای Hot Start PCR شامل موارد زیر است:

کاهش قابل توجه باندهای غیر اختصاصی
جلوگیری از تشکیل دایمرهای پرایمر (Primer-Dimers)
افزایش بازدهی محصولات هدف
نیاز کمتر به بهینه‌سازی دستی یا تکرار واکنش
کاهش خطر آلودگی نمونه به دلیل کاهش دخالت در حین آماده‌سازی

به دلیل این مزایا، PCR با شروع داغ در بسیاری از آزمایشگاه‌های تشخیصی، تحقیقاتی و کلینیکی به‌عنوان روشی استاندارد برای انجام PCR با دقت و بازده بالا مورد استفاده قرار می‌گیرد.

14. In-situ PCR

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز درجا یا In-Situ PCR یک روش مؤثر و پیشرفته است که برای شناسایی مقادیر بسیار اندک از توالی‌های نادر اسید نوکلئیک در سلول‌ها یا برش‌های بافتی منجمد یا پارافینه شده به کار می‌رود. این تکنیک نه تنها امکان شناسایی این توالی‌ها را فراهم می‌کند، بلکه موقعیت دقیق آن‌ها را نیز در درون سلول مشخص می‌نماید.

در این روش، ابتدا بافت یا سلول مورد نظر تثبیت (Fixation) می‌شود تا ساختار و مورفولوژی سلول حفظ شود. سپس، با استفاده از آنزیم‌های پروتئولیتیک (تجزیه‌کننده پروتئین‌ها) بافت یا سلول مورد نظر پردازش می‌شود تا راهی برای ورود مواد واکنش PCR به درون سلول و دسترسی به DNA هدف باز شود.

پس از ورود مواد لازم برای PCR، توالی هدف داخل سلول یا بافت توسط واکنش PCR تکثیر می‌شود و سپس به کمک روش‌های استاندارد ایمونوسیتوشیمیایی (مانند استفاده از آنتی‌بادی‌ها یا پروب‌های نشاندار) آشکارسازی صورت می‌گیرد.

مزایای استفاده از In-Situ PCR عبارت‌اند از:

تشخیص بیماری‌های عفونی از جمله ویروس‌ها یا باکتری‌هایی که دارای DNA خاصی هستند.
شناسایی و کمی‌سازی دقیق DNA حتی در مقادیر بسیار کم.
بررسی فرآیندهای رشد و تمایز در جنین و ارگان‌زایی (Organogenesis و Embryogenesis).
شناسایی موقعیت مکانی دقیق توالی ژنی مورد نظر در درون سلول یا بافت.

این روش به‌ویژه در علوم پزشکی، پاتولوژی مولکولی، زیست‌شناسی رشد و تحقیقات مرتبط با سرطان، عفونت‌ها و بیان ژن در سطح سلول‌های منفرد کاربرد گسترده‌ای دارد.

15. Intersequence specific (ISS) PCR

PCR بین توالی‌های خاص یا ISSR-PCR یک روش مولکولی برای اثر انگشت ژنتیکی (DNA fingerprinting) است که با استفاده از پرایمرهایی (آغازگرهایی) انجام می‌شود که از نواحی خاصی از ژنوم انتخاب شده‌اند؛ این نواحی دارای توالی‌های تکرارشونده هستند که در سراسر ژنوم پراکنده‌اند و در افراد یا گونه‌های مختلف می‌توانند الگوهای متفاوتی ایجاد کنند.

در این تکنیک، میکروساتلیت‌ها (توالی‌های تکرارشونده کوتاه مانند (CA)n یا (AG)n) که معمولاً 16 تا 25 جفت باز طول دارند، به عنوان پرایمر استفاده می‌شوند. در واکنش PCR، فقط از یک پرایمر استفاده می‌شود که می‌تواند چندین ناحیه مختلف از ژنوم را هدف قرار دهد. در واقع، این روش بخش‌های بین دو توالی تکرارشونده SSR (تکرارهای ساده توالی کوتاه) را تقویت (آمپلی‌فای) می‌کند.

محصولات PCR حاصل از این واکنش دارای طول‌های مختلف هستند و الگوی باندهای ژلی منحصربه‌فردی را برای هر نمونه ایجاد می‌کنند، که مانند یک "اثر انگشت ژنتیکی" عمل می‌کند.

کاربردهای ISSR-PCR:

اثر انگشت ژنتیکی برای تمایز بین گونه‌ها یا نمونه‌های مختلف

بررسی تنوع ژنتیکی بین افراد، جمعیت‌ها یا گونه‌ها

تحلیل فیلوژنتیکی (بررسی روابط تکاملی)

نقشه‌برداری ژنومی (Genome mapping)

نشان‌گذاری ژن‌ها (Gene tagging) برای اهداف اصلاح نژاد یا تحقیقات مولکولی

این روش به دلیل سادگی، حساسیت بالا، و عدم نیاز به اطلاعات ژنومی اولیه به‌ویژه در گونه‌های گیاهی یا جاندارانی که توالی ژنوم آن‌ها هنوز کامل تعیین نشده، بسیار کاربرد دارد.

16. Inverse PCR

PCR معکوس یا Inverse PCR یکی از انواع پیشرفته و خاص واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) است که در شرایطی به کار می‌رود که تنها یک ناحیه شناخته‌شده از توالی DNA در دسترس باشد، نه دو انتهای آن.

در PCR معمولی، طراحی پرایمرها نیازمند آگاهی از توالی در دو انتهای ناحیه هدف است، اما PCR معکوس امکان تکثیر DNA را حتی زمانی که تنها یک ناحیه مشخص از توالی شناخته شده است فراهم می‌سازد.

مراحل اجرای Inverse PCR:

برش DNA با آنزیم‌های محدودکننده (restriction enzymes): در ابتدا DNA ژنومی یا نمونه مورد نظر با استفاده از آنزیم‌های برشگر به قطعاتی تقسیم می‌شود.

لیگاسیون (اتصال مجدد): قطعات برش‌خورده در شرایطی قرار می‌گیرند که به صورت حلقه‌ای به هم متصل شوند (self-ligation). این حلقه شدن باعث می‌شود نواحی ناشناخته در کنار ناحیه شناخته‌شده قرار بگیرند.

طراحی پرایمر در ناحیه شناخته‌شده: از ناحیه‌ای که توالی آن شناخته شده است، پرایمر طراحی می‌شود. نکته مهم این است که جهت پرایمرها در این تکنیک بر خلاف PCR معمولی، به سمت خارج از ناحیه شناخته شده طراحی می‌شود (به دلیل حالت حلقه‌ای).

اجرای PCR: مانند سایر واکنش‌های PCR، تکثیر DNA با استفاده از DNA پلیمراز دمایی (مانند Taq) انجام می‌شود که به صورت چرخه‌ای (دمای بالا برای دناتوراسیون، دمای پایین برای اتصال پرایمر، و دمای متوسط برای گسترش رشته جدید) انجام می‌گیرد.

کاربردهای Inverse PCR:

شناسایی محل درج ترانسپوزون‌ها (jumping genes) یا عناصر متحرک ژنتیکی در ژنوم میزبان

بررسی محل ادغام رتروویروس‌ها (مانند HIV) در ژنوم سلول‌های آلوده

این تکنیک به خصوص در شرایط تحقیقاتی که اطلاعات محدودی از ژنوم موجود است، کاربردی و حیاتی است و از آن به عنوان روشی هوشمندانه برای کشف نواحی ناشناخته اطراف توالی‌های شناخته‌شده استفاده می‌شود.

مطالعه نواحی اطراف ژن‌های خاص یا توالی‌های شناخته‌شده که توالی اطراف آن‌ها ناشناخته است
ابزاری قدرتمند در ژنتیک معکوس (reverse genetics) برای بررسی عملکرد ژن‌ها

17. PCR نوع LATE (Linear-After-The-Exponential PCR)
PCR LATE یا «تکثیر خطی پس از مرحله نمایی»، نوعی اصلاح‌شده از PCR نامتقارن (Asymmetric PCR) است که از یک پرایمر محدودکننده با دمای ذوب بالاتر نسبت به پرایمر اضافی استفاده می‌کند. این طراحی باعث حفظ بازده واکنش در زمانی می‌شود که غلظت پرایمر محدودکننده در طول واکنش کاهش می‌یابد.

در آغاز این واکنش، PCR با یک مرحله‌ی نمایی شروع می‌شود که بازدهی آن مشابه PCR معمولی است. اما پس از مصرف کامل پرایمر محدودکننده، واکنش ناگهان وارد مرحله‌ی خطی می‌شود. در این مرحله، فقط از پرایمر اضافی برای تولید رشته‌ی تک‌زنجیره‌ای استفاده می‌شود که می‌تواند در طی چرخه‌های حرارتی بعدی به طور مداوم تولید گردد.

LATE-PCR بیشتر برای کاربردهایی استفاده می‌شود که به تولید رشته تک‌زنجیره‌ای DNA نیاز دارند، مانند سنجش‌های فلورسانس، طراحی پروب‌ها و استفاده در میکروآرایه‌ها.

18. PCR مبتنی بر لیگاسیون (Ligation-mediated PCR)
PCR مبتنی بر لیگاسیون، نسخه‌ای اصلاح‌شده از PCR معمولی است که امکان اجرای آن در شرایطی وجود دارد که فقط یک انتهای توالی مورد نظر شناخته شده باشد. در این روش، ابتدا یک انتهای دوم مصنوعی از طریق اتصال یک قطعه‌ی DNA خاص به نام لینکِر (linker) به توالی هدف اضافه می‌شود.

در این روش:

ابتدا DNA هدف به قطعات کوچکی تقسیم شده و به آن‌ها لینکر یا آداپتور متصل می‌شود.

سپس از پرایمرهایی که به توالی‌های لینکِر متصل می‌شوند برای شروع PCR استفاده می‌شود.

این تکنیک ابزار مهمی در مطالعات اپی‌ژنتیک، تشخیص سرطان‌ها، و تحقیق در بیان ژن‌ها به شمار می‌رود.

با استفاده از MSP می‌توان:

19. PCR دامنه بلند (Long-Range PCR)
PCR دامنه بلند نوعی تکنیک برای تکثیر قطعات بسیار بلند DNA است که با روش‌های معمول PCR نمی‌توان آن‌ها را تکثیر کرد، زیرا آنزیم‌های رایج توانایی پردازش رشته‌های بلند را ندارند.

برای اجرای این تکنیک از DNA پلیمرازهای اصلاح‌شده با قدرت اتصال و پردازش بالا استفاده می‌شود که:

دقت بسیار بالایی در کپی‌برداری دارند
قابلیت تکثیر قطعات DNA تا چندین کیلوباز (kb) را فراهم می‌کنند
زمان واکنش را کاهش داده و کارایی را بالا می‌برند

Long-range PCR در مطالعاتی نظیر:

تکثیر ژنوم کامل ویروس‌ها یا پلاسمیدها
تجزیه و تحلیل ساختار ژن‌ها یا نواحی اینترونیک
کاربرد زیادی دارد.

20. PCR اختصاصی متیلاسیون (Methylation-specific PCR یا MSP)
PCR اختصاصی متیلاسیون یا MSP روشی است برای تشخیص و بررسی الگوهای متیلاسیون DNA در نواحی غنی از CpG (موسوم به CpG islands) که اغلب در نواحی پروموتر ژن‌ها قرار دارند.

مراحل انجام MSP:

DNA ابتدا با بی‌سولفیت (Bisulfite) تیمار می‌شود، که موجب تبدیل سیتوزین‌های غیرمتیله به یوراسیل می‌گردد. در حالی که سیتوزین‌های متیله بدون تغییر باقی می‌مانند.
سپس از دو جفت پرایمر استفاده می‌شود:
- یکی برای DNA متیله‌شده
- دیگری برای DNA غیرمتیله‌شده

با استفاده از MSP می‌توان:

بررسی کرد که آیا ناحیه پروموتر ژنی دچار متیلاسیون بیش از حد شده است یا خیر.
به این ترتیب، می‌توان فهمید که بیان ژن سرکوب شده است یا نه، زیرا متیلاسیون بیش از حد پروموترها باعث خاموش شدن ژن‌ها می‌شود.

این تکنیک ابزار مهمی در مطالعات اپی‌ژنتیک، تشخیص سرطان‌ها، و تحقیق در بیان ژن‌ها به شمار می‌رود.