کیت سنتز cDNA اولترا

کیت سنتز cDNA اولترا پارس توس (Easy cDNA Ultra-TM Synthesis Kit): گامی نوین در رونویسی معکوس RNA با کارایی بالا

سنتز DNA مکمل (cDNA) از یک الگوی RNA، اولین گام و حیاتی در بسیاری از تکنیک‌های مهم بیولوژی مولکولی از جمله Real-Time PCR (RT-qPCR)، ساخت کتابخانه‌های cDNA، تعیین توالی RNA (RNA-Seq) و کلونینگ است. کیفیت و بازده cDNA تولید شده، به طور مستقیم بر دقت و موفقیت آزمایش‌های پایین‌دستی تأثیر می‌گذارد. "کیت سنتز cDNA اولترا پارس توس" (Easy cDNA Ultra-TM Synthesis Kit) یک راه حل کامل و بهینه شده است که تمامی اجزای لازم برای تبدیل کارآمد RNA کل (Total RNA) یا mRNA به cDNA تک‌رشته‌ای را فراهم می‌آورد و به ویژه برای آنالیز ژن‌های با بیان کم (low-abundance genes) طراحی شده است.

ترکیبات و فرمولاسیون منحصر به فرد کیت Easy cDNA Ultra-TM Synthesis Kit

این کیت با فرمولاسیون اختصاصی خود، فرآیند سنتز cDNA را ساده، سریع و بسیار کارآمد می‌سازد. اجزای اصلی کیت به دو بخش 2X RT Buffer Mix و Enzyme Mix تقسیم می‌شوند:

1. 2X RT Buffer Mix (مخلوط بافر رونویسی معکوس 2 برابر غلیظ): این مخلوط آماده مصرف شامل اجزای ضروری برای محیط واکنش رونویسی معکوس است: * 2X RT Buffer: بافر بهینه شده برای فعالیت آنزیم ریورس ترنسکریپتاز. * dNTP Mix (1mM): مخلوط متعادلی از چهار دئوکسی‌نوکلئوتید تری‌فسفات (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) با غلظت نهایی 1 میلی‌مولار از هر کدام در این بافر 2X. * MgCl2​ (8mM): یون منیزیم (Mg2+) یک کوفاکتور حیاتی برای آنزیم ریورس ترنسکریپتاز است. غلظت نهایی 8 میلی‌مولار در این بافر 2X برای اکثر واکنش‌ها بهینه شده است. * Oligo d(T)16: پرایمر الیگو(dT) با 16 تیمین، برای رونویسی از mRNAهای دارای دم Poly(A) در انتهای 3' استفاده می‌شود. * Random Hexamer: پرایمرهای تصادفی شش‌نوکلئوتیدی که به طور غیرانتخابی به کل مولکول RNA متصل شده و رونویسی از تمامی RNAهای موجود (mRNA، rRNA، tRNA و RNAهای غیرکدکننده) را امکان‌پذیر می‌سازند. * Stabilizer (تثبیت‌کننده): برای حفظ پایداری اجزای بافر در طول زمان و چرخه‌های انجماد/ذوب.

2. Enzyme Mix (مخلوط آنزیمی): این مخلوط شامل آنزیم‌های حیاتی و مکمل‌های لازم است: * Ultra H-minus MMLV (Thermostable) (آنزیم MMLV مقاوم به حرارت با فعالیت H-minus): این آنزیم ریورس ترنسکریپتاز، نقطه قوت اصلی این کیت است. همانطور که در توضیحات قبلی اشاره شد، این آنزیم به طور ژنتیکی اصلاح شده تا فاقد فعالیت RNase H باشد (جهت جلوگیری از تخریب RNA الگو و افزایش بازده cDNA طول کامل) و دارای مقاومت به حرارت بالا با فعالیت بهینه در دمای 55 درجه سانتی‌گراد است. این ویژگی به آن اجازه می‌دهد تا ساختارهای ثانویه پیچیده RNA را ذوب کرده و رونویسی کارآمد را از الگوهای چالش‌برانگیز فراهم آورد. * RNase Inhibitor (مهارکننده RNase): برای محافظت از RNA الگو در برابر تخریب توسط آنزیم‌های RNase داخلی یا خارجی که ممکن است در نمونه‌ها یا реагенت‌ها وجود داشته باشند. * Stabilizer (تثبیت‌کننده): برای حفظ پایداری آنزیم‌ها.

3. DEPC Treated Water (آب دی‌اتیل‌پیروکربنات تیمار شده): آب استریل و عاری از RNase است که برای رقیق کردن نمونه‌ها یا آماده‌سازی محلول‌های دیگر در واکنش استفاده می‌شود.

4. cDNA Control Primer (B2M) (Human, Mouse, Rat) (پرایمر کنترل cDNA): پرایمرهای کنترل برای ژن Beta-2-Microglobulin (B2M) در انسان، موش و رت فراهم شده‌اند. این پرایمرها برای تست موفقیت‌آمیز سنتز cDNA در PCR معمولی (Endpoint PCR) استفاده می‌شوند تا از عملکرد صحیح کیت اطمینان حاصل شود. * نکته مهم: لطفاً توجه داشته باشید که این پرایمرهای کنترل (B2M) برای استفاده در Real-Time PCR (qPCR) مناسب نمی‌باشند.

ویژگی‌ها و مزایای برجسته کیت Easy cDNA Ultra-TM Synthesis Kit:

1. پروتکل آسان و حداقل مراحل پیپتینگ: یکی از بزرگترین مزایای این کیت، سادگی پروتکل آن است. با ترکیب dNTPs، MgCl2​، و هر دو پرایمر Oligo d(T)16 و Random Hexamer در یک بافر 2X آماده مصرف، نیاز به پیپت کردن جداگانه این اجزا از بین می‌رود. این امر به طور قابل توجهی زمان آماده‌سازی واکنش را کاهش داده و "خطای تکنیکی کاربر" را به حداقل می‌رساند.

2. استفاده از آنزیم Ultra H-minus MMLV (مقاوم به حرارت): حضور این آنزیم قدرتمند و مقاوم به حرارت با فعالیت بهینه در 55 درجه سانتی‌گراد، امکان "انجام واکنش در دمای بالا" را فراهم می‌کند. این دما به طور موثر "ساختارهای ثانویه RNA" را ناپایدار کرده و رونویسی کارآمد و کامل را حتی از RNAهای پیچیده و ژن‌های با بیان کم تسهیل می‌کند.

3. سنتز cDNA بلند (Long cDNA Synthesis): فقدان فعالیت RNase H در آنزیم، تضمین می‌کند که RNA الگو در طول سنتز تخریب نشود. این ویژگی همراه با توانایی آنزیم در کار در دمای بالا، منجر به تولید cDNAهای با طول کامل و با بازده بالا می‌شود که برای آنالیزهای پایین‌دستی مانند کلونینگ یا تعیین توالی RNAهای بلند ضروری است.

4. افزایش کارایی کیت: ترکیب هوشمندانه اجزا و استفاده از آنزیم بهینه شده، منجر به افزایش کلی کارایی کیت می‌شود.

5. مناسب برای ژن‌های با بیان کم: قابلیت سنتز cDNA با بازده بالا از مقادیر کم RNA و توانایی غلبه بر ساختارهای ثانویه، این کیت را به گزینه‌ای ایده‌آل برای آنالیز ژن‌های با بیان کم که شناسایی آن‌ها دشوار است، تبدیل می‌کند.

6. پشتیبانی از هر دو نوع پرایمر (Oligo d(T) و Random Hexamer): حضور همزمان این دو نوع پرایمر در بافر 2X، انعطاف‌پذیری کیت را برای رونویسی از mRNAهای کامل و یا تمام RNAهای موجود در نمونه (Total RNA) افزایش می‌دهد.

7. کیفیت تضمین شده: محصولات پارس توس با استانداردهای کنترل کیفیت بالا تولید می‌شوند، که این کیت نیز از این قاعده مستثنی نیست.

ملاحظات مهم:

• عدم مناسبت برای miRNA: کیت به دلیل وجود پرایمرهای Oligo d(T) و Random Hexamer در بافر خود، برای کار روی miRNA (میکرو RNA) مناسب نمی‌باشد. برای آنالیز miRNAها، پروتکل‌های خاصی با پرایمرهای اختصاصی نیاز است. در این موارد، استفاده از محصول آنزیم MMuLV به همراه بافر ویژه آن توصیه می‌شود.

• نگهداری: این محصول باید در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود تا پایداری و فعالیت آنزیم‌ها و реагенت‌ها حفظ شود.

نتیجه‌گیری:

کیت سنتز cDNA اولترا پارس توس (Easy cDNA Ultra-TM Synthesis Kit) یک راه حل جامع، کاربرپسند و با کارایی بالا برای تبدیل RNA به cDNA است. با بهره‌گیری از آنزیم H-minus MMLV مقاوم به حرارت، پروتکل ساده، و فرمولاسیون بهینه که شامل تمامی реагенت‌های لازم است، این کیت سنتز cDNA با بازده بالا و طول کامل را حتی از الگوهای RNA پیچیده یا ژن‌های با بیان کم تضمین می‌کند. این محصول ابزاری ضروری برای محققان در حوزه‌های مختلف بیولوژی مولکولی است که به دنبال نتایج دقیق و قابل اعتماد در آزمایش‌های مبتنی بر RNA هستند.