ستون متالوکروماتوگرافی NIIDA

ستون متالوکروماتوگرافی Ni-IDA پارس توس: ابزاری کارآمد برای خالص‌سازی پروتئین‌های نوترکیب His-tag

در بیولوژی مولکولی و بیوتکنولوژی، تولید و خالص‌سازی پروتئین‌های نوترکیب برای مطالعات ساختاری، عملکردی و کاربردهای دارویی بسیار حیاتی است. یکی از رایج‌ترین و موثرترین روش‌ها برای خالص‌سازی این پروتئین‌ها، استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی یون فلز (IMAC - Immobilized Metal Affinity Chromatography) است. این روش بر پایه میل ترکیبی خاص بین یون‌های فلزی (مانند نیکل) و توالی‌های اسید آمینه‌ای خاصی در پروتئین، به نام برچسب پلی‌هیستیدین (Polyhistidine-tag یا His-tag)، استوار است. "ستون متالوکروماتوگرافی Ni-IDA پارس توس" یک ابزار با ارزش و مقرون به صرفه است که به منظور خالص‌سازی سریع و راحت پروتئین‌های نوترکیب دارای His-tag طراحی شده است.

Ni-IDA Column چیست و چگونه عمل می‌کند؟

"Ni-IDA Column" یک نوع ستون کروماتوگرافی است که برای خالص‌سازی پروتئین‌ها با استفاده از برچسب His-tag به کار می‌رود. مکانیسم عمل آن به شرح زیر است:

1. برچسب His-tag: این برچسب معمولاً شامل شش باقی‌مانده هیستیدین متوالی (شش‌تایی His-tag) است که به انتهای N- یا C-ترمینال پروتئین نوترکیب مورد نظر اضافه می‌شود. این کار از طریق مهندسی ژنتیک انجام می‌گیرد.

2. پایه جامد و لیگاند IDA: ستون حاوی یک ماتریکس رزین (ژل) است که به عنوان "تکیه‌گاه جامد" عمل می‌کند. این ماتریکس با گروه‌های ایمینو دی استیک اسید (IDA) که به عنوان لیگاند (ligand) شناخته می‌شوند، عامل‌دار شده است. IDA یک عامل کلات‌کننده (chelating agent) است که می‌تواند به یون‌های فلزی خاص متصل شود و آن‌ها را روی رزین تثبیت کند.

3. اتصال یون‌های فلزی: "توالی His-tag به کاتیون‌های Ni2+ (یون‌های نیکل دو ظرفیتی) متصل می‌شود که با استفاده از گروه‌های اسید ایمینو دی استیک (IDA) روی یک تکیه‌گاه جامد تثبیت می‌شوند." این یون‌های Ni2+ به گروه‌های IDA روی رزین متصل شده‌اند و در نتیجه، یک سطح فعال برای اتصال His-tag ایجاد می‌کنند.

4. اتصال پروتئین هدف (Binding): هنگامی که نمونه حاوی پروتئین نوترکیب His-tag از ستون عبور داده می‌شود، باقی‌مانده‌های هیستیدین در His-tag میل ترکیبی بالایی به یون‌های Ni2+ متصل به رزین دارند. این برهم‌کنش، پروتئین هدف را به ستون متصل می‌کند.

5. شستشو (Washing): پس از اتصال پروتئین هدف، ستون با بافرهای شستشو (wash buffers) شسته می‌شود. این بافرها برای حذف "ناخالصی‌ها" (مانند سایر پروتئین‌های سلولی، اسیدهای نوکلئیک، لیپیدها و سایر آلاینده‌ها) که به ستون متصل نشده‌اند یا به صورت ضعیف متصل شده‌اند، استفاده می‌شوند. این مرحله تضمین می‌کند که پروتئین خالص‌سازی شده دارای حداقل آلودگی باشد.

6. شستشو (Elution): "پروتئین‌های خالص‌شده با برچسب His را می‌توان با ایمیدازول یا محلول pH کاهش‌یافته شستشو داد."

   • ایمیدازول: ایمیدازول یک آنالوگ ساختاری هیستیدین است. هنگامی که ایمیدازول با غلظت بالاتر به ستون اضافه می‌شود، برای اتصال به یون‌های Ni2+ با His-tag پروتئین هدف رقابت می‌کند. ایمیدازول با اتصال به یون‌های فلزی، پروتئین هدف را از ستون جدا کرده و آن را در فاز مایع شستشو می‌دهد.

   • محلول pH کاهش‌یافته: کاهش pH محیط باعث پروتونه شدن باقی‌مانده‌های هیستیدین در His-tag و کاهش میل ترکیبی آن‌ها به یون‌های فلزی می‌شود، که منجر به جداسازی پروتئین از ستون می‌گردد.

مزایای ستون متالوکروماتوگرافی Ni-IDA پارس توس

• خالص‌سازی سریع و راحت: پروتکل خالص‌سازی با استفاده از این ستون، بسیار ساده و سریع است، که زمان مورد نیاز برای جداسازی پروتئین را به حداقل می‌رساند.

• یک مرحله‌ای: "این برهمکنش یون هیستیدین و فلز، خالص‌سازی یک مرحله‌ای را برای پروتئین‌ها از هر سیستم بیانی، تحت شرایط غیر دناتوره یا دناتوره کننده ممکن می‌سازد." این به معنای کاهش مراحل و زمان لازم برای خالص‌سازی است.

• قابلیت خالص‌سازی در شرایط مختلف:

  • خالص‌سازی در شرایط غیر دناتوراسیون (Native Conditions): برای پروتئین‌هایی که باید ساختار طبیعی و فعالیت بیولوژیکی خود را حفظ کنند، این روش ایده‌آل است.

  • خالص‌سازی در شرایط دناتوراسیون (Denaturing Conditions): برای پروتئین‌هایی که در محیط سلولی به صورت تجمعات نامحلول (inclusion bodies) بیان می‌شوند، می‌توان از بافرهای دناتوره کننده (مانند اوره یا گوانیدینیم کلرید) برای حل کردن پروتئین و خالص‌سازی آن استفاده کرد.

• عملکرد بالا و خاص: میل ترکیبی بالا و اختصاصی His-tag به یون‌های نیکل، منجر به خالص‌سازی پروتئین با خلوص بسیار بالا و بازدهی مناسب می‌شود.

• بسیار مقرون به صرفه: با توجه به قابلیت استفاده مجدد و شارژ چندین باره، این ستون در درازمدت اقتصادی عمل می‌کند.

• قابلیت شارژ مجدد ژل: "این ژل بیش از ده بار بدون کاهش عملکرد قابل شارژ است." و "این ژل تا حداقل 8 بار قابل شارژ می‌باشد." (این اختلاف در تعداد دفعات شارژ ممکن است به دلیل تفاوت در شرایط آزمایشگاهی، کیفیت اولیه شارژ و پروتکل دقیق شارژ مجدد باشد. توصیه می‌شود برای طول عمر بیشتر و حفظ عملکرد، به حداقل دفعات ذکر شده اکتفا شود و در صورت نیاز به تعداد دفعات بیشتر، عملکرد به دقت پایش شود).

  • "ستون نیکل برای تخلیص یک نوع پروتئین تا 2 بار بدون شارژ نیکل قابل استفاده می‌باشد ولی برای تخلیص دو نوع پروتئین باید شارژ مجدد نیکل انجام شود تا عاری از پروتئین قبلی شده و تخلیص پروتئین بعدی به درستی انجام شود." این نکته مهمی برای جلوگیری از آلودگی متقاطع پروتئین‌ها است.

اجزای ستون متالوکروماتوگرافی Ni-IDA پارس توس

• Ni-IDA Resin: رزین اصلی که حاوی گروه‌های IDA متصل به یون‌های Ni2+ است. این رزین "به صورت سوسپانسیون در اتانول 20٪ عرضه می‌گردد" که به عنوان یک نگهدارنده عمل می‌کند.

• Column & head and bottom plugs: خود ستون پلاستیکی با درپوش‌های بالا و پایین برای پر کردن و آب‌بندی.

• Filter (polypropylene frit): فیلترهای پلی‌پروپیلن در بالا و پایین ستون برای جلوگیری از خروج رزین.

بسته‌بندی و نگهداری

"این محصول در حجم 5 میلی‌لیتر (حجم رزین) بسته‌بندی شده و در بسته های تک عددی و 5 عددی به فروش می‌رسد." "شما می‌توانید بسته 5 عددی را با قیمت مناسب‌تر تهیه فرمایید." این گزینه برای آزمایشگاه‌هایی که نیاز به خالص‌سازی مکرر دارند، مقرون به صرفه است.

"⚠︎ نکته: این محصول باید در یخچال 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شود." "Ni-IDA resin به صورت سوسپانسیون در اتانول 20٪ عرضه می‌گردد و در دمای اتاق پایدار است." (توجه داشته باشید که در یک بخش به "یخچال 4 درجه سانتی‌گراد" و در بخش دیگر به "دمای اتاق پایدار است" اشاره شده است. بهترین توصیه برای حفظ پایداری طولانی‌مدت، نگهداری در یخچال 4 درجه سانتی‌گراد است، مگر اینکه تولیدکننده صراحتاً پایداری در دمای اتاق را برای دوره‌های طولانی تأیید کرده باشد). "تمام معرف‌ها تا 24 ماه در شرایط نگهداری مناسب پایدار هستند. از یخ زدن محصول خودداری گردد." یخ زدن می‌تواند به ماتریکس رزین آسیب برساند و عملکرد آن را مختل کند.

نکات مهم قبل از شروع کار

"لطفاً قبل از شروع کار حتماً بافر پروتئین بررسی شود که عاری از مواد احیاکننده باشد." مواد احیاکننده (مانند DTT یا بتا-مرکاپتواتانول) با یون‌های Ni2+ واکنش داده و می‌توانند آن‌ها را احیا کرده یا با آن‌ها کلات تشکیل دهند. این امر باعث جدایی یون‌های فلزی از رزین و در نتیجه از دست دادن ظرفیت اتصال ستون می‌شود. بنابراین، نمونه‌ها و بافرهای مورد استفاده در مراحل اتصال و شستشو نباید حاوی مواد احیاکننده باشند. در صورت نیاز به استفاده از مواد احیاکننده، باید پس از مرحله خالص‌سازی و با روش‌های دیگر (مانند دیالیز) اضافه شوند.

نتیجه‌گیری

"ستون متالوکروماتوگرافی Ni-IDA پارس توس" یک راه حل قوی، کارآمد و مقرون به صرفه برای خالص‌سازی پروتئین‌های نوترکیب حاوی His-tag است. این ستون با تکیه بر اصول کروماتوگرافی میل ترکیبی یون فلز، امکان دستیابی به پروتئین‌های با خلوص بالا را تحت شرایط مختلف (دناتوره یا غیردناتوره) فراهم می‌کند. قابلیت شارژ مجدد ژل، آن را به ابزاری پایدار و اقتصادی برای هر آزمایشگاه بیولوژی مولکولی و پروتئومیکس تبدیل کرده است. با رعایت نکات نگهداری و استفاده صحیح، این محصول می‌تواند به طور قابل توجهی در پیشبرد پروژه‌های تحقیقاتی و تولید پروتئین‌های کاربردی کمک شایانی کند.