آنزیم DNA پلیمراز Pfu

آنزیم DNA پلیمراز Pfu پارس توس یک آنزیم DNA پلیمراز ترموستابل (مقاوم به حرارت) با Fidelity بالا است که از باکتری بسیار گرمادوست Pyrococcus furiosus استخراج شده است. این آنزیم به خانواده B آنزیم‌های DNA پلیمراز تعلق دارد و دارای وزن مولکولی حدود 90 کیلودالتون است.

ویژگی‌های کلیدی آنزیم DNA پلیمراز Pfu پارس توس:

• Fidelity بالا: مهم‌ترین ویژگی آنزیم Pfu، دقت بسیار بالای آن در تکثیر DNA است. این آنزیم دارای فعالیت تصحیح کنندگی اگزونوکلئازی 3' به 5' (3' > 5' exonuclease proofreading activity) است که به آن امکان می‌دهد نوکلئوتیدهای اشتباه وارد شده در طول سنتز DNA را تشخیص داده و حذف کند. میزان خطای آنزیم Pfu پلیمراز حدود 1 در 1.3 میلیون جفت باز به ازای تشکیل قطعه 1 کیلوبازی در PCR است. این دقت بیش از 10 برابر بیشتر از آنزیم Taq پلیمراز (با میزان خطا حدود 1 در 9000 نوکلئوتید) است.

• تولید محصولات PCR با انتهای صاف: آنزیم Pfu پلیمراز برخلاف آنزیم Taq، پس از تکثیر DNA، انتهای صاف (blunt ends) ایجاد می‌کند و فاقد فعالیت اضافه کردن بازمانده آدنین (3'-dA overhang) در انتهای 3' محصولات PCR است. این ویژگی در برخی روش‌های کلونینگ که به انتهای صاف نیاز دارند (مانند کلونینگ با آنزیم‌های محدودالاثر که انتهای صاف ایجاد می‌کنند) اهمیت دارد.

• پایداری حرارتی بالا: آنزیم Pfu پلیمراز پایداری حرارتی بیشتری نسبت به آنزیم Taq پلیمراز دارد، که می‌تواند در چرخه‌های PCR با دماهای بالا مفید باشد.

• سرعت پلیمریزاسیون کمتر: سرعت پلیمریزاسیون آنزیم Pfu نسبت به آنزیم Taq کمتر است. به طور معمول، برای تکثیر هر 1 کیلوباز DNA در دمای 72 درجه سانتیگراد، به حدود 2 دقیقه زمان نیاز دارد. این در مقایسه با سرعت بسیار بالاتر آنزیم Taq (حدود 10 ثانیه برای 1 کیلوباز) است.

• مناسب برای PCR با Fidelity بالا و قطعات کوتاهتر از 3kb: آنزیم Pfu برای واکنش‌های PCR و واکنش‌های گسترش پرایمر که نیاز به دقت بسیار بالا در تکثیر DNA دارند، به ویژه زمانی که طول قطعه PCR کمتر از 3 کیلوباز باشد، انتخاب مناسبی است. برای تکثیر قطعات بسیار طولانی، ممکن است از مخلوطی از آنزیم‌ها (از جمله آنزیم با Fidelity بالا و آنزیم با سرعت بالا) استفاده شود.

• آنزیم نوترکیب با خلوص بسیار بالا: آنزیم Pfu پلیمراز پارس توس به صورت پروتئین نوترکیب با درجه خلوص بسیار بالا تولید می‌شود. خلوص بالا برای اطمینان از عملکرد صحیح آنزیم و جلوگیری از فعالیت‌های جانبی ناخواسته ضروری است.

• فرمولاسیون بافر بهبود یافته: این محصول با فرمولاسیون جدید بافر ارائه می‌شود که عملکرد آنزیم را افزایش می‌دهد.

• اجزای کیت: کیت آنزیم Pfu DNA پلیمراز پارس توس معمولاً شامل اجزای زیر است:

  • Pfu DNA Polymerase (با غلظت 5 واحد در میکرولیتر - 5 U/μl)

  • محلول MgCl₂ با غلظت 25 میلی‌مولار (MgCl₂ Solution 25mM) - برای تنظیم غلظت نهایی یون منیزیم در واکنش PCR.

  • بافر 5X Pfu فاقد MgCl₂ (5X Pfu Buffer MgCl₂ free) - برای ایجاد شرایط بهینه واکنش، کاربر باید MgCl₂ را به غلظت نهایی مورد نظر اضافه کند.

• حجم‌های ارائه شده: این محصول در دو حجم 250 واحد (U) و 500 واحد (U) تولید شده است و حجم 500 واحدی با قیمت مناسب‌تری در دسترس است. واحد فعالیت (U) معمولاً به صورت مقدار آنزیمی تعریف می‌شود که قادر به وارد کردن 10 نانومول نوکلئوتید در DNA در 30 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد باشد.

• شرایط نگهداری: برای حفظ کیفیت و پایداری آنزیم، این محصول باید در فریزر با دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری شود.

کاربردهای آنزیم DNA پلیمراز Pfu پارس توس:

• PCR با Fidelity بالا: برای کاربردهایی که نیاز به تکثیر دقیق DNA دارند، مانند کلونینگ، بیان پروتئین نوترکیب، تعیین توالی و آنالیز جهش‌ها.

• PCR برای تولید قطعات DNA با انتهای صاف: برای کلونینگ با استفاده از آنزیم‌های محدودالاثر که انتهای صاف ایجاد می‌کنند.

• واکنش گسترش پرایمر با دقت بالا.

• برخی از روش‌های جهش‌زایی هدفمند (Site-directed mutagenesis).

نکات مهم در استفاده:

• به دلیل سرعت پلیمریزاسیون کمتر آنزیم Pfu، زمان‌های Extension در چرخه PCR ممکن است نیاز به افزایش داشته باشد (حدود 2 دقیقه به ازای هر 1 کیلوباز).

• غلظت MgCl₂ در واکنش PCR باید بهینه شود. کیت معمولاً یک محلول MgCl₂ جداگانه ارائه می‌دهد تا کاربر بتواند غلظت مناسب را تنظیم کند.

• استفاده از بافر ارائه شده همراه با آنزیم برای دستیابی به بهترین عملکرد توصیه می‌شود.

آنزیم DNA پلیمراز Pfu پارس توس با دقت بسیار بالا در تکثیر DNA و ایجاد انتهای صاف، یک انتخاب عالی برای کاربردهایی است که Fidelity در آن‌ها اهمیت حیاتی دارد. اگرچه سرعت آن نسبت به Taq کمتر است، اما دقت بالای آن، این آنزیم را برای بسیاری از تحقیقات پیشرفته در بیولوژی مولکولی ضروری می‌سازد. امکان تهیه آن در دو حجم مختلف، نیازهای گوناگون کاربران را پوشش می‌دهد.